发酵香肠菌种的筛选鉴定与环境因子对其发酵过程中微生物的影响

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20盯届石河子大学硕士研究生毕业论文IV 学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果．据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果．对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均巴在文中作了明确的说明并表示谢意．研究生签名：卫参爱时问：们年／月∥日学位论文版权授权书本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版．有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅．有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索．有权将学位论文的标题和摘要汇编出版．保密的学位论文在解密后适用本规定．研究生签名：Z盘乏时问：勿刁年厂月扩日时问：o伊力年／月夕日 20们届石河子大学硕士研究生毕业论文第一章文献综述1．1立题背景与意义1．1．1发酵香肠的定义及其种类1．1．1．1发酵香肠的定义发酵香肠是指在自然或人工控制条件下，利用微生物、酶的发酵作用(特定温度、湿度条件1，加工成的具有特殊色、香、味、质地和较长保质期的产品。发酵香肠可分为传统自然发酵香肠和现代人工控制发酵香肠两大类，传统自然发酵香肠具有悠久的历史。据考证，西式发酵香肠的制作起源于地中海地区，那里的气候温和，湿度大，有利于发酵香肠的成熟。早在2000多年前，罗马人就知道用碎肉加盐、糖和香辛料能够制成美味可口的香肠，而且这类产品具有较长的储藏期，不过当时的产品主要是通过自然发酵和成熟干燥制成的干香肠，这类产品至今在欧洲的一些国家仍很普遍。至今发酵香肠不仅在欧美各国广为流行，深受消费者青睐，包括中国在内的一些国家也对其产生浓厚兴趣，消费者不断增多，成为这些地区产品开发的首选对象【l羽。1．1．1．2发酵香肠的种类·发酵香肠是指将碎肉、脂肪、香辛料、糖、腌制剂和发酵剂等混合后灌入肠衣，经微生物发酵而制成的特有稳定的微生物特性和感官特点的肉类制品，属于欧洲传统的肉制品类型，德国、意大利、西班牙和法国香肠的产量和人均消费量都是比较高的。发酵香肠的正式分类方法因国家而异，具体的标准有水分含量、蛋白质含量、水与蛋白质比例、重量损失等。从微生物的角度看，发酵香肠最好根据水分活度和外观处理进一步进行分类14J。(如下表1．1)表1．1．发酵香肠的种类Tabl一1．Thecategoryoffermentedsausage1．1．2发酵香肠的特点发酵香肠是应用微生物发酵技术加工出的具有特有风味、色泽、质地和营养，且具有较长保存期的高档肉制品。肉品通过微生物的发酵，肉蛋白的分解如氨基酸，大大提高了其消化性，同时必需氨基酸、维生素和益生素增加，营养性和保健性增强，微生物发酵分解为氨基酸形成大量香味成份，从而使其产品具有特有风味。肉品中大量有益微第1页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响生物的存在，可起到对致病菌和腐败菌的竞争抑制作用，同时有益微生物发酵可形成杀灭不利菌的抑制菌素，从而保证产品安全性，延长产品货架期寿命。因此，发酵香肠具有风味独特，易于消化、营养丰富，易于贮藏等特点，是西式传统肉制品的优秀代表，在肉品中占据着独特的地位。1．1．3发酵香肠的发展现状及存在的问题1．1．3．1国外发酵香肠的现状及存在的问题发酵香肠的生产现在采用的是标准化工业生产模式，生产完全建立在物理学、化学和其它相关科学的基础上，工艺参数可以做到完全量化，计算机进行控制，生产工艺成熟，产品质量稳定。同时，拥有完善的加工设备，便于实现工业化生产，产品生产周期短，消费量呈上升趋势【4】。但是在国外工业化发酵肉制品生产中也存在一定问题。(1)发酵香肠的安全性，尤其是溶血性大肠杆菌的爆发使发酵香肠的安全受到很大的威胁。(2)发酵香肠中的生物胺降解问题，由于影响发酵过程中生物胺降解的因素比较多，因此目前仍是研究的热点。1．1．3．2国内发酵香肠发展概况及存在的问题国内对发酵香肠的研究相对比较落后，但也取得了明显的进步。目前对其研究的重点是从传统的优良发酵肉制品中筛选适合发酵香肠生产的优良发酵剂，并对其筛选出来的菌种进行复合发酵来改变由单一发酵所带来的颜色比较暗淡、风味不足等缺点，然后研究发酵香肠的理化、微生物以及感官指标的变化规律。我国发酵肉制品的生产普遍存在以下问题【5叫：(1)没有适合发酵香肠专用的发酵剂；(2)发酵香肠的安全性问题；例如，致病菌、生物胺等；(3)没有真正弄清楚发酵香肠发酵过程中微生物的菌相变化规律；‘(4)没有弄清产品品质变化规律的关系；(5)干品肉类发酵剂比较落后；(6)生产周期长，产量低，生产成本高，阻碍了工业化生产的步伐。由于以上原因，导致我国发酵香肠的产品质量不稳定，产品附加值低。1．1．4立题依据我国地域广阔，全国各地有很多名优的发酵肉制品，存在很多优良的自然菌株，可以作为优良肉品发酵剂的来源。我国研究者对肉品发酵剂菌种的筛选作了一些研究，大多是直接将筛选的菌种简单应用于发酵香肠试验，没有详细的研究所筛选的菌株在发酵香肠发酵过程中微生物的菌相变化规律，更很少有具体研究其发酵过程中环境因子对微生物的影响以及微生物的预测预报17-8】。因此，通过对来自我国不同生态条件下的发酵食品(主要是发酵肉制品)中的菌株进行筛选、鉴定，建立了一条完整的发酵肉制品菌种筛选体系，筛选出适合发酵肉制品的优良复合菌种，用中心组合试验设计优化出适合肉第2页共7‘夷 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文品发酵剂增殖的培养基，制备出高浓度的肉品发酵剂。然后运用响应曲面法研究发酵香肠发酵过程中各主要微生物类群与环境因子间的关系，从而避免由于发酵香肠发酵所采用的多菌种混合发酵带来的安全性问题，为实现发酵香肠工业化生产的工程控制，为发酵香肠生产过程中微生物的预测预报提供依据。1．2国内外研究现状1．2．1发酵香肠菌种的研究现状1．2．1．1发酵剂的种类及应用香肠中应用的发酵剂主要包括霉菌、酵母和细菌三大类，它们可以单独添加，也可以混合使用，一般混合使用效果更佳。常用的发酵剂种类见下表l一2：目前，国外对乳酸菌的研究主要集中在新菌株和细菌素高产菌株的筛选，以及基因工程菌株的构建。利用分子生物学手段(例如SDS-PAGE蛋白质模型，或者用遗传学方法，包括DNA／DNA杂交，rRNA序列分析，16S和23Sr心队．寡核苷酸探针，核糖测定，限制性内切酶模型以及多态DNA的随机扩增技术)将具有优良性状的外源基因，如细菌素基因，导入乳酸菌，是乳酸菌研究的方向，国外己进行大量试验。Blaiotta2000等综合应用16SrDNAV3区的变性梯度凝胶电泳和16S．23SrDNA间隔区的多态分析来鉴定从意大利发酵香肠中分离出来的葡萄球菌。Blaiotta2000等设计了木糖葡萄球菌的木酮糖蛋白(xym)和60k．Da的热激蛋白(bsr60)基因的引物，然后运用种特异性的PCR分析快速可靠地鉴定了从干发酵香肠中分离出来的木糖葡萄球菌。LCoeolin，M．Manzano等用聚合酶链式反应和温度剃度凝胶电泳从自然发酵的意大利香肠中快速鉴定出了乳杆菌属。另据报道，也有人己成功地将溶葡萄球菌素基因转入乳酸菌，提高乳酸菌抑制金黄色葡萄球菌的能力。关于乳酸菌另一个研究方向是不具有氨基酸脱羧酶和具有胺氧化酶菌株的筛选[91。胺氧化酶能氧化脱氨生物胺而产生醛、H202和氨，而醛又可进一步氧化成酸，可被微生物用作碳源，从而消除生物胺的危害性i101。国内对发酵香肠的发酵剂主要集中在乳酸菌的筛选上以及符合中国人口味的发酵剂。王玉芬【¨J等(2004)从我国不同生态区的多个自然发酵肉制品中优选出一株戊糖片球菌19，利用PCR技术验证了鉴定结果。牛天贵【眩1(2004)研究了葡萄球菌和微球菌的分离筛选，并确定了其和乳酸菌混合培养发酵的相互关系。山东大学I”】刘站丽(2003)从清酒乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌、肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌五株菌中筛选出适合中式快速发酵香肠生产的发酵剂。李开雄f14l等(2002)研究了酵母菌在发酵香肠中的作用以及霉菌在发酵香肠的作用。王海燕I”1(2002)从一种发酵香肠混合发酵剂中分离、筛选出13株菌种，测定了筛选菌株的产酸能力和产生的脂酶和蛋白酶活性，确定了合适的发酵参数和工艺，并研究了发酵香肠在发酵成熟过程中谢值的变化与微生物生长的关系。第3页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响表1．2．发酵香肠发酵剂中常用的微生物种类‘1。21]Tabl-2．ThestarterclllturesiIIferrncllmdsavage1．2．1．2发酵香肠菌种的筛选原则|22谢】(1)安全性作为发酵剂的菌种，必须对人体无害，应是革兰氏阳性非致病菌，不产内源毒素，不产生生物胺，不产氨基甲酸乙酯；(2)耐盐性在6％的盐水能够正常生长；(3)耐亚硝酸盐在80-100ppm的浓度下生长良好；(4)能在15M0℃温度范围内生长，且最适生长温度范围30．37℃；(5)乳酸菌必须是同型发酵，具有适量产生乳酸的能力，与原料肉中的乳酸茵能够簟4更共7‘页 2ee7届石河子大学硕士研究生毕业论文有效竞争；(6)发酵不会使产品产生异味；(7)代谢不产黏液，不产H2S，不产C02，不产过氧化氢，分解精氨酸不产Nrrf-13；(8)可产过氧化氢酶和硝酸还原酶；(9)应具有提高产品风味的能力；(10)对致病菌和腐败菌有秸抗作用，对其它发酵剂菌株有协同作用；(11)具有抗冷冻干燥特性目前有学者使用酶制剂来代替发酵剂，缩短成熟时间，但酶制剂不能完全代替发酵剂，这是因为：(1)发酵剂中的酶大部分为内源酶，很难从菌株中分离提取；(2)酶制剂不能拮抗病原菌和腐败菌。1．2．1．3微生物分离、鉴定技术研究进展及趋势125J菌种的鉴定工作是各类微生物工作的基础工作，也是重点工作。微生物经典的分类鉴定方法，是相对于现代的分类、鉴定方法而言的。常规(传统)的微生物分类、鉴定方法主要是根据形态特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应等作为鉴定依据。这种鉴定方法还停留在细胞形态和习性水平上，鉴定工作需要测定的项目众多，时间长，不能适应快速鉴定的需要。近年来，随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用，形成了细胞化学组分分析(包括细胞壁成分、细胞氨基酸库、脂类、醌类光合色素等的分析，所用技术除常规实验室技术外，还有红外光谱、气相色谱和质谱分析等新技术)、蛋白质水平鉴定(包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等现代技术)、遗传学特性鉴定(如DNA的G+C含量测定、核酸分子杂交同源性测定、16SrRN寡核苷酸序列分析、PCR技术和基因探针等)以及利用电子计算机进行数值分类研究的快速鉴定系统和编码鉴定方法(如ATP．生物荧光自动检测系统、电阻法检测系统、数值(编码)鉴定、自动化鉴定仪和网络化自动化鉴定系统等)等快速先进的方法，使得微生物的鉴定不限于一般表型指征的鉴别，而且深入到基因型性状的鉴定，在研究自然界各类群微生物种类及其相互间的亲缘关系等方面发挥了重要作用。同时，也极大地促进了食品微生物和食品检疫检验等研究领域的发展，食品中病源性致病微生物和致腐性腐败微生物的快速检测和鉴定，为食源性疾病的控制和食品安全的保障提供了快速、可靠的科学手段。1．2．2发酵香肠的生产工艺及其研究发酵香肠的生产主要包括配料、发酵和成熟干燥三个阶段。从发酵的温度来划分，可把发酵香肠的生产工艺划分为两大类：一是以欧洲的低温发酵法为代表，发酵温度一般不超过24℃：一是以美国的高温快速发酵法为代表，发酵温度一般都高于24‘C，有的甚至采用40℃的高温进行快速发酵。加工工艺及流程图如下图所示：加速发酵香肠的成熟，缩短生产周期能提高生产厂家的设备利用率和资金周转速度，提高企业的效益和竞争力。对发酵香肠加速成熟的研究起源于上个世纪90年代。加速发酵干香肠成熟的措施有提高发酵温度；采用基因改造的微生物发酵剂以及添加酶第5页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响制剂等方法。注；A包括瘦肉和脂肪；B包括盐和亚硝酸盐；C包括填充料、糖、香辛料、抗坏血酸、酸化物质田1．1发酵香肠的加工工艺及流程图Figl一1．Thep|静∞鹳technologyandflowchartoffermentedsausage近十余年来国外对加速成熟的研究主要集中在蛋白酶和脂肪酶在发酵干香肠生产中的应用，试图通过外源性蛋白酶和脂肪酶的加入来加速肉馅中蛋白质和脂肪的降解和挥发性风味物质的形成，从而加速发酵香肠的成熟。人们用于加速发酵香肠成熟的脂肪酶主要为动物源和微生物源的脂肪酶。Naes等(1995)，Sandtorv等(1995)和Hagen等(1996)对来自干酪乳杆菌类干酪亚种(LactobacillusparacaseisubspparacaseONCD0151的蛋白酶对干发酵香肠成熟的影响进行了进一步深入的研究，结果表明这种酶能降低产品的pH值，增加乳酸的产生量，加大水分的丢失，蛋白质的降解，肽链的形成，以及增加谷氨酸、丝氨酸和赖氨酸的含量。Diaz等(1991，1992，1993，1994，1996，1997)把不同浓度的蛋白酶E(来EiStrptomycesgriseus)，天冬氨酸蛋白酶(来自米曲霉却唧oryzae)和木瓜蛋白酶加入到西班牙式干发酵香肠中，通过电泳发现，由于加入的蛋白酶的作用，增加了香肠中含氮化合物，包括水溶性氮，非蛋白氮，磷钨酸溶性氮，硫代水杨酸溶性氮和总挥发性氮的含量，尤其是在发酵阶段增加最多。同时也增加了总游离氨基酸和胺的含量(主要为赖胺和组胺)。AIIsorena等(1998)对蛋白酶和脂肪酶同时用于加速发酵香肠的成熟进行了研究。现在应用联机传感器测量不同的发酵参数(温度、pH、相对湿度、空气流速、产品平衡湿度)(Rodel和Stiebing)，测量的参数用于发酵控制(Stiebing和Rodel)，这可以缩短成熟时间，减少由人工调节成熟气候或由一个车间向另一个车间转移产品的劳动第‘页共76夏 2007届石河子大学硬士研究生毕业论文量。同时用电子的方式可以获得大量致病菌活动的资料(Ross和McMeekin，1994)，也可预测香肠中的乳酸菌受水分活度、温度和其他参数影响的情况。(Landvogt和Fisher，1991)、Demeyerdx组、Verlindenj}1]Spliet(1994)发表了香肠发酵的数学模型，以上这些工具在优化现有工艺和发展新工艺方面是有帮助的[41。1．2．3发酵香肠安全性的研究现状在过去几年里，国外主要研究的重点是抑制致病菌(尤其是溶血性大肠杆菌)和胺的形成。另外，使香肠成熟过程中的微生物和化学变化更具有预知性的研究也一直受到关注，这也是香肠生产的标准化与自动化的先决条件。1．2．3．1筛选能够产抗菌素的发酵剂用能够产抗菌素的发酵剂不仅能够提高发酵香肠的质量，同时通过抑制致病菌和有害的微生物来增加香肠的安全性(Vogeleta1．1993，Hugasetal．1995)。在过去几年里，一些与乳酸菌有关的抗菌素有所报道，并对其进行了深入的研究。到目前为止，由清酒乳杆菌产生的几种抗菌素已经研究清楚，如下：sakacinA(SchillingerandLueke，1989)，sakaeinM(Sobrinoeta1．，1992)，sakaeinP(Tiehaczeketa1．，1992)，sakacin674(Holcketa1．，1994)，sakaeinB(Sameliseta1．，1994)，sakaeinK(Hugascta1．，1995)，andsakaeinT(Aymcrichc￡a1．，2000)，所有的抗菌素都具有较强的抗李斯特菌活性。同时，三种由弯曲乳杆菌产生的抗菌素也已经发现：curvacinA(Tiehaezeketa1．，1992)，eurvatiein13(Sudirmaneta1．，1993)。andcm'vadcmFS47(CarverandMurimm,1994)。别的抗菌素在肉品的发酵中分离所得：plantarieinBN(Lew砒andMontviIle，1992)，laetoein705(Vignoloeta1．，1993)，aeidoeinBandsalivaricinB(tenBrinketa1．，1994)，bavarieinMN(WinkQwskiandMontville，1992)，plantaricinD(Aymvricheta1．，2000)和enteroc／nsAandB(H踟ranzetaL，2001)1261。Garrigaeta1．(1993)对LaetobaeillussakeCTC372产生的抗菌素(sakacinT)进行了研究，结果表明这种抗菌素具有明显的抑制李斯特菌和金黄色葡萄球菌的效果。同时Hugascta1．(1995)也对工6．sakeCTC494产：生的抗菌素瞻．，。。。。。。。。，“。。。I№m(sakacinK)抑制李斯特菌的生长进行了研究。麓怒蛊嚣怒≯“4“。“。”“”“““Leroyetal(2005)研究了发酵香肠的成分和工艺因素对抗菌素Lb．sakeiCTC494的影响，确定了盐、亚硝酸盐、镁离子、锰离子、氧和脂肪都是其主要的影响因素。VuystL．D(2000)建立了发酵香肠发酵过程的数学模型，确定了影响抗李斯特菌素SakaeinK的含量的主要环境因素是温度和pH，并优化了发酵香肠的工艺，确定了产抗李斯特菌素SakaeinK的最佳温度和pH分别为：23℃、5．0和25℃、5．5(如上图)127J。1．2．3．2发酵香肠中生物胺的种类19I第7页共％页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子埘其发酵过程中徽生物的影响生物胺是有机体的基础，在一些食物中是以脂族的、芳香族的和杂环结构为基本结构。在食物中，它们主要由微生物引起氨基脱羧的作用产生的(除了生理学的多元胺)，积累生物胺要利用前体，需要有产生氨基酸脱羧酶这种微生物的存在，还要有利它们生长和脱羧作用的环境。组胺、丁二胺、苯乙胺、色胺、尸胺、精胺和亚精胺是食物中的重要生物胺，由于影响发酵香肠中生物胺的因素比较多，因此各个国家的发酵香肠中的生物胺含量也不相同。1．2．3．3发酵香肠中致病菌的预测预报12”21预测微生物学发展的源动力及目的在于：在对食品中微生物不进行检测和分析的前提下，快速对食品的安全性做出判断。这样预测微生物学的研究方法大体分为两种：(1)研究环境条件的改变对微生物生命活动的影响，其手段在于通过建立数学模型(预测模型)，最终确定能够指导实际生产的参数——迟滞期或微生物生长条件因素，此方法己较为成熟，是预测技术的主流；(2)研究微生物关于食品从原料到消费全过程，随环境条件的改变，食品可能出现的情况。埃希氏菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌是发酵香肠中重要的致病菌，有可能在传统的没有加工的干发酵香肠中生存，李斯特菌的生长受内因子和外因子共同的影响，比如pn值、氯化钠、亚硝酸钠、发酵剂等。金黄色葡萄球菌具有比较强的繁殖能力和产生较强毒性的致病菌，大多采用具有抗金黄色葡萄球菌的乳酸菌来降低尤其是E．coli0157：H7具有较强的耐酸性，引起了溶血性大肠炎的爆发。Sameliseta1．(2005)用离子辐射的技术控制了用于生产千发酵香肠的冷冻肉中埃希氏菌大肠杆菌(EscherichiacoliDJ5乃王∥)和李斯特菌的数量。Noreddineeta1．2003对在发酵香肠中由Lactococcualacticsubsp．1aaisM产生的抗菌素降低ListeriamonocytogenesATCC7644的数量与抑制它的生长进行了研究。Hugascta1．2002研究了用胡椒粉和锰作为促进因子来增强sakacinK抑制李斯特菌的能力。Messenseta1．2003建立了科学的数学模型，研究了在欧洲发酵香肠中温度和pH值的变化对LactobacilluscUrVdtUsLTH1174产抗菌素的影响，研究表明在温度为25℃左右时细菌素产量比较高。Case),etal．2000研究了环境因子对发酵香肠中埃希氏菌大肠杆菌的影响，经研究发现pH值和亚硝酸盐对其影响比较大，随着亚硝酸盐浓度的增大，大肠杆菌的死亡速度逐渐加大。Francoiseta1．，2003研究了在纯鸡肉干发酵香肠中两种商业发酵剂和不同的乳酸钠浓度以及它们的交互作用产酸鲋能力，目的是确定抑制Salmonellaspp和李斯特菌的最佳条件。GonzaActa1．，1999研究了西班牙加调料的口利左香肠生产中生产和干燥条件对金黄色葡萄球菌的影响，研究表明低的温度和发酵剂对抑制金黄色葡萄球菌有明显的效果。预测微生物学与神经元网络技术的结合使得数学模型的预测更为精确。Geeraerd用人工神经元网络(Artificialneuralnetworks)作为非线性模型技术预测冷藏食品中微生物生长情况，并提出一种新数学模型灰匣子模型(Greyboxmodel)，该模型以Gompertz模型和非线性微分方程为基础，其优点在于当环境因素增加时，可以通过增加模型中的第8更共佰页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文神经元来完成对模型的扩展。Hajmeer用计算神经元(Computationalileul'alnetworks)代替非线性回归方程，对福氏痢疾杆菌(Shigellaflexneri)在厌氧条件下的增殖、死亡进行了研究，其预测精度优于传统的非线性回归方程。1．2．4响应曲面法对发酵肉中微生物的影响【3"6l响应面法(ResponseSurfaceMethodology)是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。响应面法目前已成为降低成本、优化加工条件的一种有效方法，广泛地应用于农业、生物、食品、化学等领域。响应面法郦M)主要有三种常用的试验设计方案：Box．Behnken设计、均匀外壳设计(UniformShellDesign)均匀外壳设计和中心组合设计(CentralCompositeDesign)(杨文雄2005)。李宗军(2004)用响应曲面试验设计，研究了盐浓度、水分活度、发酵温度、发酵时间和糖浓度等环境因子对肉品发酵过程中的细菌总数、乳酸细菌、微球菌和酵母菌的影响，确定了有显著性影响的环境因子，建立了科学的数学模型，优化了传统酸肉的生产条件。用建立的数学模型对发酵过程中的微生物进行了预测，结果可靠。这为肉品发酵过程的控制，提高发酵肉制品的安全性，缩短生产周期提供了依据，也是微生物预报的重要基础。，“Gardinieta1．(2001)用响应面法研究TpH值、温度和NaCl的浓度之间的交互作用E．faecalisE37产生物胺的影响。研究表明，当NaCl的浓度上升的时候，生物胺的积累量明显的下降，而此时蛋白质水解的活性明显的提高，并指出它们之间没有明显的关系。然而在PH值比较高时，生物量的含量比较高，与高浓度的菌体密度有一定的相互关系。Buchanan&Phillips(1990)用响应曲面法的数学模型研究预测了温度、pH值、氯化钠的浓度、亚硝酸钠的浓度和大气成分等环境因子与发酵香肠中大肠杆菌0157：H7、李斯特菌的影响。Buchananeta1．在以前研究的基础上，用响应曲面法的数学模型研究了包括亚硝酸盐的变化浓度在内的多种环境因子对大肠杆菌0157：H7的影响。Barbut&Gri缸iths用响应曲面法建立了降低干发酵香肠中E∞矗DJ57数量的数学模型，经过SAS软件分析，确定了Aw、pH、T、加热时间是降低发酵香肠中E．coli0157数量的重要因素。Aw和pH与E．eoli0157数量的降低呈负效应，T和加热时间E．coli0157数量的降低呈正效应，为发酵香肠的安全奠定了基础。1．3本实验研究的内容1．3．1筛选出适合发酵香肠生产的发酵剂，并对菌种进行鉴定：对分离纯化的8株菌进行基本发酵特性实验和主要发酵特性实验，从而筛选出活力第9页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响比较强的几株菌，最后对筛选出的几株菌进行生理生化鉴定，确定出几株菌的名称。1．3．2SAS软件优化肉品发酵剂(植物乳杆菌)增殖培养基的研究；通过SAS软件中的Plackett-Burman实验设计从众多的促进因子中快速的筛选出几种重要的影响因素，然后运用中心组合设计优化出最佳的适合工业化生产高效浓缩型冻干发酵剂增殖培养基。1．3．3研究发酵香肠发酵过程中的微生物及理化特性的变化趋势；用不同的发酵剂制作发酵香肠，研究发酵香肠在发酵成熟过程中菌落总数、乳酸菌和葡萄球菌的变化规律以及它们之间的相互关系。然后研究发酵香肠的理化特性如：pH值、Aw、总氮、游离氨基酸、亚硝酸盐的残留量的变化趋势。1．3．4研究不同发酵剂对产品品质的影响：研究不同混合发酵剂对发酵香肠发酵成熟过程中的质构、色泽、感官品质的影响，从而筛选出一组比较好的发酵剂作为下一步的研究。1．3．5响应曲面法评价环境因子对发酵香肠发酵成熟过程中主要微生物的影响；由于发酵香肠在发酵成熟过程中受环境因子的影响比较显著，本实验用响应曲面法来研究环境因子如盐浓度、水分活度、糖浓度、发酵时间和发酵温度对发酵香肠发酵过程中主要微生物如菌落总数、乳酸菌和球菌的影响，主要是确定发酵香肠发酵过程中的菌相变化规律，为优化工艺和微生物的预测预报提供理论依据。第l●页共％页 2007届石河子大学硬士研究生毕业论文第二章发酵香肠菌种的筛选及鉴定2．1前言【3S-3S]在肉制品发酵中，乳酸菌起了至关重要的作用。并不是所有的乳酸菌都适合作为肉品发酵剂。如有的在肉品环境中缺乏竞争性，有的影响肉品的感官品质(如产生H202、H2S等)，乳酸菌的性能差异对产品质量会产生很大的影响，因此筛选优良的乳酸菌作为发酵剂是发酵肉制品加工的关键。我国传统肉制品的生产具有非常悠久的历史，如中外驰名的金华火腿、宣威火腿以及品质优良的中式香肠等与民间传统发酵型肉制品，由于其良好的特殊风味，深受国内外消费者的青睐。国内现有的发酵肉制品资源丰富，品质风味比较好，其微生物结构比较复杂，广泛存在着优良的自然菌株，可以作为分离、筛选优良菌株的来源。我国传统发酵食品中存在很多优良的菌种资源，从发酵食品分离、纯化乳酸菌，对它们的主要发酵特性进行了研究，了解乳酸菌之间的差异，为生产不同类型的发酵肉制品提供乳酸菌菌种资源。以生产发酵香肠为前提，从中筛选乳酸菌发酵剂。2．2实验材料方法与仪器设备2．2．1菌种及来源RHX4、RH33来源于金华火腿；RFx3、RFxl、RF2ISl、RF231，AFx5来源于发酵香肠；RL32，ALx3来源于腊肠，上面纯化的菌种由石河子大学畜产品实验室提供。RB3来源于泡菜，分离纯化的菌种由石河子大学食品学院实验室提供。2．2．2培养基【39-40](1)MRS培养基MRS液体培养基：蛋白胨109，牛肉膏109，酵母提取物59，K2HP0429，柠檬酸二铵29，乙酸钠59，葡萄糖209，吐温80lml，MgS04·7H200．59，MnS040．259，蒸馏水1000ml，pH值6．2-6．4，121℃灭菌20min。MRS固体培养基：在液体培养基的基础上添加1．8％的琼脂。(2)耐盐(NaCl)性试验培养基MRS固体(液体)培养基分别添加4％和6％浓度的NaCl。(3)耐亚硝酸盐性试验培养基MRS固体(液体)培养基按150mg／kg添加NaN02。(4)产粘性培养基MRS固体培养基，用蔗糖代替葡萄糖。(5)葡萄糖产气培养基蛋白胨Ig、NaClO．59、葡萄糖1g、蒸馏水100mI、pH7．4，配制时将蛋白胨先加热溶解，调到pH之后，加入溴甲酚紫溶液(1．6％水溶液)，待呈紫色，再加入葡萄糖，使之溶解，分装试管，最后将杜氏小管倒置放入试管中，0．05MPa灭菌30min。第1l页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响(6)产H2S培养基FeS04穿刺法：牛肉膏7．59，蛋白胨109，NaCI59，明胶59，10％FeS04(培养基灭菌后无菌加入)5mL，蒸馏水1000n1L，pH7．0，112℃灭菌20rain。培养基灭菌后，在明胶尚未凝固时，加入新制备的过滤除菌的FeS04，用无菌试管分装培养基，高度为4-5cm，立即置于冷水中冷却凝固，供穿刺接种用。(7)产氨培养基脱脂牛奶100ml，NaCl0．59，0．05MPa灭菌15min。(8)H202产生检测培养基下层基础培养基：蛋白胨109，牛肉膏lOg，酵母提取物59，脏温80lnfl，MnS040．259，琼脂89，蒸馏水1000ml，pH值6．2-6．4，121"C灭菌20min。单独灭菌的无菌糖l％(葡萄糖)量添加。上层培养基：在上层培养基的基础上，加入4％的lvm02。(9)氨基酸脱羧酶培养基蛋白胨59，酵母提取物39，葡萄糖19，蒸馏水1000ml，1．6％溴甲酚紫乙醇溶液lml，L-氨基酸59或DL-氨基酸lOg，pH6．8。∞石蕊牛乳培养基脱脂牛奶100ml、1％石蕊乙醇溶液。将脱脂牛奶的pH调至中性，用1％石蕊溶液液，将牛奶调至早淡紫色偏蓝为止，分装试管，牛奶高度4cm为宜，O．05MPa灭菌30ndn。OD硝酸盐还原培养基蛋白胨lg，NaClO．59，KNOaO．1-0．29，pH值7．4，121℃灭菌15·20min。凹v-P反应培养基葡萄糖59，蛋白胨59，NaClO．59，K2HP04O．59，蒸馏水1000ml，pH7．0～7．2，0．05MPa灭菌30nfin。∞营养肉汤培养基牛肉膏209，蛋白胨209，葡萄糖log，NaCDOg，NaN020．159，调节为pn6．5，0．051vIPa灭菌20rain。2．2．3实验方法14IJ(1)产粘性实验：本实验采用MRS固体培养基，其中用蔗糖代替葡萄糖。接种，30"(2培养24小时，用接种针挑取菌落直接观察。(2)耐盐性实验：将R类菌种接种到添加有4％和6％NaCl的MRS液体培养基中，30℃培养24小时，用722型分光光度计650nm测定0D值，比较其生长情况，以MRS培养基作空白对照。(3)耐亚硝酸盐性实验：将R类菌种接种到添加有150mg／kgNaN0。的MRS液体培养基中，30℃培养24小时，650nm测定oD值，比较其生长情况，以MRS培养基作空白对照。“)H：0：产生：新鲜培养物于H如产生检测培养基划线，培养5天。观察菌落周围，变澄清者为H202阳性。摹12页共"页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文(5)产氨实验、葡萄糖产气实验、产H2S实验、石蕊牛乳实验、氨基酸脱羧酶实验参照东秀珠(2001)的方法。2．2．4R类优良菌株的筛选及其生长特性(1)R类优良发酵菌株的筛选比浊法原理：在比色计上进行测定培养液中微生物的数量。某一波长的光线，通过浑浊液体后，其光线强度被减弱。根据朗伯．比耳定律。A=Log丢o=kbc若样品液浓度b一定，则A值与样品的浊度相关，根据此原理，可通过测定样品中的A值来代表培养液中微生物数量。在发酵肉制品的生产中，R类优势菌株应该具有能够耐6％NaCI’和150mg／kgNAN02、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不产H202、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等特点，同时部分菌还具有硝酸盐还原性等。(2)蛋白质降解活性试验采用添加15％脱脂乳的MRS固体培养基，分别滴入lml个菌液涂布均匀，30℃，培养8h。当牛乳中酪蛋白被分解后，茵落周围会出现透明环，以此判定4个菌种有无分解蛋白质的性质。(3)脂肪分解活性试验采用添加15％猪油和中性红指示剂的MRS固体培养基，分别滴入Iml各菌液涂布均匀，30℃，培养48h。当菌种分解脂肪产生脂肪酸时，培养基上会出现红色斑点。(4)R类菌株生长曲线和pH值(产酸能力)的测定将筛选得到的4株菌接种于MRS液体培养基，30℃培养24小时，以MR液体培养基为空白对照，每2小时用722分光光度计于650rim测定菌液的OD值，用酸度计测定pH值。记录数据并绘制生长曲线。(5)R类菌株在不同温度下的生长情况将4株菌接种于MRS液体培养基，分别在10℃、15℃、25"(2、30"C连续培养24小时，以MRS液体培养基为空白对照，于650nm测定OD值，并测定pH值。(6)R类菌和球菌混合培养两株乳酸菌RB3、RFxl和AFx5、ALx3分别在MRS和MSA液体培养基活化两次，在模拟肉汤培养基中混合培养，每4h测定pH值及乳酸菌和球菌数(稀释平板法)，选择没有拮抗关系的复配方案。2．2．5菌种的鉴定14212．2．5．1形态特征鉴定(1)菌落形态观察分离培养基平板上菌落的形态(形状、色泽、大小等)，并记录结果。(2)菌株形态将所分离的菌株进行革兰氏染色，于100倍油镜下观察菌体形态(大小、形状等)，并记录观察结果。第13页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响2．2．5．2生理生化特征鉴定(1)菌株的特殊生理特征实验(2)各种碳源发酵情况：通过菌株的糖醇发酵实验，来检验菌株对各种糖醇类碳源的利用性状，并记录结果。2．2．6统计分析【43删方差采用SAS9．0进行分析。2．2．7主要仪器与设备表2-1实验仪器及设备Tab2-1．Experimentequipmentandinstrument还有电子显徽镜、电子显徽成像系统、电子分析天平、电热炉、超声波滑洗机等。2．3结果和分析2．3．1R类优势菌的基本发酵特性分析从表2-2可知这8株R类菌都具有能够耐6％NaCl和NaN02、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不产H202、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸等特点。这些结果表明，8株菌可以耐受发酵香肠的特定环境，并且满足其筛选条件，可以作为不同类型发酵香肠发酵剂的来源。簟14页共'6页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文表2-2筛选的乳酸菌的主要发酵特性菌株特性RB3RI-133RF261RJ．42RHx4RFxtRJblRFx38株R类菌在MRS培养基中的产酸情况如上表2-3所示，酸度变化情况表明，不同菌株之间产酸速度差异没有明显的差异性(p>O．05)，在24h之后大部分菌可使pH降低到4．0以下，具有明显的显著差异性(p<0．0t)。菌株的产酸速度与产酸能力不一致，有些菌株产酸能力强，但是产酸速度并不快，这与Coppola．R(1998)报道一致。考虑到乳酸菌要抑制病原菌的生长，人们认为产酸速度比产酸能力更能衡量菌株的标准。根据产酸速度的情况，我们选择RL32、RB3、RH33和RFxl作为下一步筛选的对象。2．3．3R类菌的主要发酵特性分析2．3．3．1耐盐(NaCl)性分析通过将R类菌接入MRS液体培养基、添加有4％、6％浓度的NaCl的MRS液体培养基，30℃培养24小时，然后在650rim处测定吸光值。本研究根据比浊法原理，微生物在液体培养基中吸光度值的变化作为微生物生长的指标，研究菌种的耐盐性。第15页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响RFxlRB3RH33RL3瘟株IlFxlRB31n133RL32菌株图2-1不同NaCI浓度下各种菌的OD值图2-2不同NaN02浓度下各种菌的OD值Fig．2一lTheODvalueofeverysll'ainatdifferentFig．2—1TheODvalueofevcrystrainatdifferentNaClconcentrationNaN02concentration由图2—1可以得出各种菌在不同盐浓度的吸光值的变化，随着盐浓度的不断增加，各种菌的生长受到一定的抑制，但是在4％、6％浓度的NaCl浓度下，这些菌都可以正常生长，所以以上几种菌对4％、6％浓度的NaCl都有明显的耐受性(P<0．05)。2．3．3．2耐亚硝酸盐性分析将R类菌接入MRS液体培养基、添加有150mg／kg浓度的NaN02的MRS液体培养基，30"C培养24小时，然后在650rim处测定吸光值。结果见图2-2，通过上图分析，可以看出，所筛选的R类菌可以在150mg／kgNaN02浓度下很好的生长，说明所筛选菌株可以耐受150mg／kgNaN02。2．3．3．3蛋白质降解能力表2-4筛选的乳酸菌的发酵特性m出2．4．Thefermentationcb．amctcristicsofselectedlacticacidbacteria一爱不无活性；+表不弱活性(直径{d}0．05)，RFxl刚开始生长最快，最后比较缓慢。RH33和R工口2基本保持一致，RB3刚开始时生长比较缓慢，但最后达到最大值，超过了其它三株菌。从上图可以看出，随着培养时间的延长，四株菌的菌体密度逐渐达到最大，在4h后到达对数生长期，此时菌体密度增加。24h后到达稳定生长期，此时菌体密度达到最大值，是菌体的最佳收获时期。图2-3不同乳酸菌24h的生长曲线图2-4不同乳酸菌24h内的pH值变化Fig．2-3ChangesofdensityfordifferentLacticaddFig．2-4ChangesofpHfordifferentLacticaddbacteriaduring24hoursbacteriadttring24hours2．3．3．624h内的产酸能力分析一将R类菌接种于MRS液体培养，30"(2连续培养24小时，以空白培养基为对照；。每2小时测定一次，用酸度计测定pH值，得到结果如图2_4所示：2．3．3．7不同温度菌株的生长情况o．炉1．OO·80．6O．40．20．0RL32RH33RFxlRB3菌株RL32RFXlRB3RH3萄株闰2-5不同温度下菌株的生长情况固2．6不同温度下菌株的产酸能力Fig．2—5ThegrowthsituationofdifferentFig．2-6Theabilitytoproduceacidofdifferenttemperatureonstrainstemperatureonstrains从上面四种菌24小时pH值曲线变化看，产酸能力都比较强，各株菌的产酸能力不具有明显的显著性(p>O．05)。在培养初期pH值不断下降，随着时间的延长，这种下降趋势逐渐变缓，RFxl、RH33、RL32三种菌株的生长曲线大体一致。RB3下降速度刚开第17页共76页∽诅耀揖剐囡∽J器-匿：一一目朦霆呖匿nv_1一垦图塑廑直}州6泊5拍4¨3 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响始比较缓慢，最后下降速度比较快，到24小时后四株菌的pH均能达到4．00。由图2—5可以看出，不同温度对每种菌株影响不同，4株菌最适生长温度都为25℃。大部分菌株在不同温度下的生长速度差异极显著(p<0．01)，温度从15"C～25"C上升至的过程中，生长速度随温度的上升加快，温度继续上升，生长速度反而下降。2．3．3．10不同温度菌株的产酸能力从图2-6可以看出，不同温度下菌株的产酸能力不同，但都具有明显的显著性(p<0．01)，四株菌在25"C和30"C下都具有很好的产酸性能。从目前生产发酵香肠的工艺来看，发酵的温度基本为20"C左右。综合考虑选择RFxl和RB3作为发酵香肠的发酵剂进一步进行鉴定。2．3．4微生物的鉴定根据菌株在常温、低温条件下的生长状况分析，R类菌株选择RFxl、RB3作为筛选鉴定对象。固体培养特征：30"(2培养2d，在MRS+3％CaC03固体培养基上形成明显的透明圈，表面光滑湿润。液体培养特征：培养过程中，细菌达到最大浑浊度后，菌体逐渐沉淀到培养基底部。2．3．4．1两株菌的形态特征表2-5两株菌的菌落形态Tab2-5．Themorphologyof2sn妇菌株编号菌落形态RFxlRB3菌落比较大，中间突起的比较明显。菌落较小，色泽比较透明，颜色一致2．3．4．2两株菌的镜检结果表2-6两株菌的镜检结果Tab2-6．Themicroscoperesultsof2swains2．3．4．3两株菌的生理生化特征根据RFxl、RB3表型特征和生理生化特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定砒’x1为德氏乳杆菌，RB3为植物乳杆菌。2．3．5混合培养的关系产生混合发酵剂时，涉及到微生物共培养过程中微生物之间的相互关系的研究。两种微生物的相互关系通常有以下三种情况：(1)两种菌株通过各自的代谢活动有利于对方，或偏利于对方表现为一种特殊的互生关系；(2)一个菌株产生的代谢产物抑制甚至杀死另一种微生物，即拮抗关系；(3)还有一种情况是，微生物之间相互没有影响。第18页兆％页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文豳2·7模拟肉汤培养基中RFxl和AFxs、ALx3混合培养的相互关系Fig2-7RelationshipbetweenRFxlandAFxs、ALx3whenco-cultureinsimulativebroth图2-8模拟肉汤培养基中RB3和AFxs、ALx3混合培养的相互关系Fig2-8Relationshipbe4【weellRB3andAFxs、ALx3whenco-c：llltureinsimulativebroth图2-7和2．8列出了两株乳酸菌和肉糖葡萄球菌及变异微球菌混合培养时的情况，pH和菌数的总变化趋势是：培养12h内pH值下降速度最快，之后下降缓慢；乳酸菌数均逐渐增加，在培养16h内上升较快，之后基本保持稳定；肉糖葡萄球菌基本上与乳酸茵的趋势一样，只不过是数量相对来说比较少。肉糖葡萄球菌与乳酸菌混合培养的过程中，在RB3与AFx5、ALx3混合培养过程中，球菌的数量相对RFxl与AFx5、ALx3培养过程中的球菌数量要多一些，球菌的数量(对数值)达到了7．84，乳酸茵的数量达到了8．92。乳酸菌和肉糖葡萄球菌共培养时，主要由于乳酸菌的代谢产物以及引起的条件改变(乳酸、缺氧、细菌素等)抑制肉糖葡萄球菌的正常生长。2．4、结论(1)所筛选的乳酸菌都能耐受4％和6％NaCl和150mg／kg亚硝酸盐，它们具有很好的发酵特性：不产粘液；能使牛奶酸凝；葡萄糖发酵不产C02；不生成H2S；不产氨；第19页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响生长过程中不产H202t不具有氨基酸脱羧能力等，并且具有很好的产酸能力，能抑制大肠杆菌的生长。(2)本实验从8株R类菌中筛选出两株性能比较良好的菌株RFxl和RB3，经鉴定得出RFxl为德氏乳杆菌，RB3为植物乳杆菌。第"页共％页 2e09届石河子大学硕士研究生毕业论文第三章响应曲面法优化肉品发酵剂(植物乳杆菌)增殖培养基的研究3．1前言[45-551浓缩冷冻干燥发酵剂的研制首先需要获得高浓度的菌体。而高浓度的菌体首先可以通过培养基的优化设计来实现。乳酸菌的生长需要多种生长促进因子，国内有很多关于对乳酸菌增殖培养基进行优化的报道，但多采用单次单因子法和正交设计方法。单次单因子法(Onevariableafa向le)在考察的因素较多时，这种方法不仅费时，也无法解释因素间的交互作用。正交试验设计不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达方式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。Plackett-Burrnan(PB)设计法是一种两水平的试验设计方法。它可以利用最少的试验次数从众多的考察因素中快速有效地筛选出主要的影响因子，故而被广泛地用于因子效应的估计中。响应面法(ResponseSUl噶scemethodology,KSM)是一种优化过程的综合技术，采用该法可以建立连续变量曲面模型和回归方程，可同时对影响因变量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价。因此它可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，该法己经广泛地应用于各类培养基以及发酵条件的优化实践中。本研究应用这一方法对影响植物乳杆菌增殖培养的促进因子进行了快速的筛选，不仅节省了大量的时间，同时也对各种因素之间的交互作用进行了分析比较，从而保证了实验的精确性。3．2试验材料与方法3．2．1供试菌种植物乳杆菌(LRB3)由上面筛选鉴定所得。3．2．2培养基及培养条件活化及计数培养基：ⅫRs培养基。各种增殖培养基：以加瞄培养基为基础，按照实验添加各促进因子。各促进因子的制各方法：番茄汁的制备：将经过挑选、洗净的番茄破碎，放置5分钟，加热至70"C后立即冷却到室温，然后连续打浆和砂布过滤分离，即可得到番茄汁。胡萝p汁制备：对胡萝b进行选料、清洗、切片，在锅中煮45．60分钟，然后用3倍的水进行打浆，砂布过滤备用。马铃薯汁：先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小薄片，称200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后进行打浆，用砂布进行过滤，其滤汁为马铃薯汁。玉米浸出汁；称取12．59玉米粉边搅拌边倒入300ml水中，60。C水浴保温lh。此悬第2l页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响液用滤纸过滤后，滤液恢复到300ml，即为玉米浸出汁。麦芽汁：用啤酒液进行代替(本实验所用啤酒均为珠江啤酒)。豆粕水解液：豆粕用酸(调pH=4．2)进行水解24h所得。发酵液的制备：活化后的植物乳杆菌以体积分数为1％的接种量接入MRS液体培养基中，37"C静置培养至稳定期(约lah)后灭菌制得。3．2．3培养方法及测定方法采用稀释倒平板法，将活化后的菌种稀释成1o-1至1矿9个稀释度，取lo-7、1矿、l旷3个稀释度进行接种培养，吸取lml各稀释液于灭菌培养皿中，然后倒入冷却至45～50"C的加有不同浓度的各促进因子的固体培养基中混匀，每种培养基接种每个稀释度2个平皿。然后放入37"C恒温培养箱中培养48h。将37"C恒温培养了48h后的各培养皿取出，对各培养皿进行菌落计数，最后对同一培养基同一稀释度的菌落数求平均值。每三种促进因子为一组，最后一组只有一种促进因子，共5组。结果以107cfu／ml{R告菌体浓度。3．2．4实验设计根据有关文献记载，在蛐蝎培养基中添加一定量的番茄汁、胡萝卜汁、麦芽汁(用啤酒代替)、土豆汁、玉米汁、发酵液、乳清粉、乳糖(或蔗糖或麦芽糖)、CaCh，蜂蜜、半胱氨酸盐酸盐以及豆粕水解液可能促进乳酸菌的生长，另外培养基初始pH值也是影响乳酸菌菌体生长的一个重要因素。因此，本次实验以MRS培养基作为基础培养基，对分别添加不同浓度(由下面的实验所定)的上述促进因子进行实验。3．2．4．1单因素实验设计表3-1单因素实验表头设计促进因子浓度促进因子浓度番茄汁(ml／1)10305070蔗糖(刚)l357胡萝b汁(ml／1)10305070蜂蜜(g／1)1357土豆汁(ml／1)10305070乳清粉(妒)5152535啤酒(ml／1)10305070CaCh(ga)0．51．01．52．0玉米汁(ml／1)10305070半胱氨酸盐酸盐(妒)0．30．40．50．6豆粕水解液(ml／1)5101520pH值6．06．46．77．0发酵液(ml／1)103050703．2．4．2Plackctt-Burnaan实验设计本实验从13种促进因子中筛选重要因素，即因素数k=13。通过对单因素实验进行分析，选定各促进因子的高低水平，并以L-RB3的菌体浓度为响应值，采用Plackctt-Burman设计法筛选植物乳杆菌的生长强化因子。借助SAS设计PB表头进行设计实验，具体操作如下：运行SAS，选择“ASSrr，’工具，再选‘'Planningtools'’，然后进入‘'DesignofEXP”，选择菜单项‘'Newdesign”子项第控页共76页 2007届石河子大学顼士研究生毕业论文‘'Defineandcreate”设计一个新的实验。随后进入实验表头设计界面，输入相关参数。在‘'Design'’中输入实验名称，即‘'N=20的Plaekett-Bttrman实验设计与结果”；在‘'Type'’选择‘'Two-level'’两水平设计；在因素‘'Factors'’依次输入‘‘A，B，．．⋯．Q'’共17个因素，其中有13个实际因素，4个空项，每个因素取2个水平，即‘'low=-'’，‘'high=+，’；在响应值‘'Responses”输入“菌落数(x107efu／m1)”；在实验点数n，‘'Numberofruns”输入20；在‘'Model’’选择“Screening'筛选重要因素。完成以上步骤，SAS给出如表3-4所示[561。3．2．4．3RSM(中心组合)实验设计根据Plackett-Burman试验结果，选择可信度大于99％的四个因素作为响应面设计的变量，分别记蔗糖、啤酒、乳清粉和培养基的初始pH值为变量x1、)【2、x3、x4，在这四个因素中，产生负效应的因素选取表3-5中的低水平值，产生正效应的因素选取高水平值。以L-RB3的菌落数(x107cfu／m1)为响应值，记为变量Y。设计四因素五水平的旋转中心组合实验，各因素水平的取值如表3．2所示。表3-2四因素五水平表头T曲3-2n壕tableoffotwfaggtor8andfivelevels因素编码值代号项目一2．1012Xl蔗糖(g／1)2．23．03．84．65．4x2啤酒(raPl)‘30507090110x3乳清粉(胡)3．55．06．58．09．5x4PH值5．66．06．46．87．2中心组合设计的总实验总数为2K+2K+n，其中K代表自变量总数，n代表中心点实验数。自变量五按下式进行编码变换：置：．Xf-Xoill，2，3⋯．，k，’AX式中，而为自变量墨的编码值，五为自变量五在中心点的值，AX为自变量变化步长。用标准多项式回归方法，对实验数据进行拟合，便得到一个二次多项式，该方程为描述响应量(应变量)和自变量关系的经验模型。对于2因子系统，模型可描述为：y=flo+∑觑+∑岛#+∑fl#Xixj+6if／99％的4个因素蔗糖、乳清粉、啤酒和培养基的pH值影响RB3生长的重要因素。作为重要因素蔗糖、乳清粉、啤酒对菌落数有正效应，即在MRS培养基中加X3．8朝的蔗糖的增菌效果明显优于加入3．09／l的蔗糖；加X6．59／l的乳清粉的增菌效果明显优于加入5．O鲈的乳清粉；加入70mFl的啤酒的增菌效果明显优于加入56ml／L的啤第柚页共％页 2@07届石河子大学磺士研究生毕业论文酒。而培养基的pH值对菌落数有负效应，即培养基的初始pH值为6．4时的增菌效果优于pH值为7．0时的增菌效果。表3-5Placketc-Bum柚试验设计的因素、水平及影响效果Tab3-5VariablesandeffectsofPlackett-Burmandesign望至查兰三三匡!：!：t-Test概率No项目高(+)低(·)∑(-)]／10A番茄汁(mL／L)37．530．01．21．35280％B胡萝h汁(ml／L)62．550．0-1．4·1．578800AC土豆汁(ml／L)12．510．0—1．5-1．690800D空项．⋯⋯0．91．014<800AE蔗糖(g几)3．8，3．0，4．95．52299．9％F蜂蜜(g／L)3．83．00．20．225<800,／0G乳清粉(g／L)6．55．03．13．49399．5％H空项⋯1．31A6580％I啤酒(mL／L)70．056．04．24．73399．9％J玉米汁(nil／L)62．550．00．40．451<80％K豆粕水解液(ml／L)20．015．01．92．14195％L空项⋯_o．1-0．113娼D％MCaCl2(g／L)0．50．4—1．5—1．690800,4N半胱氨酸盐酸盐(g／L)0．40．3-1．0一1．127<80％O发酵液(ml／L)50．040．00．00．000O％P空项⋯0．801902<800,4QPH值7．06．4-3．7．4．16999．9％3．3．3、RSM实验结果及讨论中心组合实验设计及结果如表3．6所示。3．3．3．1中心组合实验结果3．3．3．2方差分析表3-7．二次项响应面的回归分析及决定系数Tab3-7．AnalysisofvarianceandthecoefficientofdeterminationforSecond-ordermodelfittedtoresponsesurface里塑查茎查望自由度兰垄翌望垄翌!堡P值RegressionSourceDFSSMSFValue一次项二次项交互项失拟项回归模型／model纯误差4610141616．1216678．0115233．363750’1．40416727A969392．2127384．030416752．002880750．56062500O．140416701．9640670．13829629．1414，484．051．0414．2<0．o001O所以方程有极大值。然后再利用一般求驻点的方法即可求得极值点。对上面的回归方程中的各变量求一阶偏导数并令其为零，则有乡幺=o．25-0．34xI一0．24x2—0．02x3+o．24而=o乡乞=o．17—0．24xi一0．46x2—0．18x3+o．07x4=o乡乞=o．55—0．02而一0．18x2—0．80x3+o．24x4=0％=-o．53+0．23xi+o．07x2+o．24x3-0．66x4=o第35页共76页西一讹立蛾西一蚍毋一解 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响即一0．34一O．24一O．02O．23—0．24—0．46一O．180．07一O．02—0．18一O．800．24O．230．07O．24一O．66一O．25—0．17一O．550．53从而求得xl=0．63668，x2=-0．25896，)【3=o．61648,X4=-0．37238．于是该点极值为14．3113。如下表所示：表3-9响应面的规范分析Tab3-9CanonicalAnalysisofResponseSurface由图3-14～3．16及表3-9结果可知，回归模型存在稳定点，y(×108cfll／m1)的最大估计值14．3113。四个主因素取值分别为：4．309／1蔗糖，64．8ml／l啤酒，7．429／l乳清粉，培养基初始pH值为6．25。在以上优化条件下进行验证试验，共进行3次实验，结果见表3．10。证明预测值14．31x108cfu／ml与验证试验平均值13．90x108cfu／ml接近，证明了实验的精确性。表3．10优化条件下的验证实验Tab3-10Verificationexperimentonoptimizedconditions3．4结论3．4．1、在单因素实验中，确定了各促进因子的最佳增菌浓度分别为：30ml／l番茄汁，50ml／1胡萝b汁，50ml／1玉米汁，10ml／l土豆汁，50ml／l啤酒，10ml／1豆粕水解液，50ml／l发酵液，59／l乳清粉，O．59／lCaCh，0．39／l半胱氨酸盐酸盐，39n蔗糖，39／1蜂蜜，培养基的最佳初始pH值为6．7。3．4．2、通过PB实验设计，从13个促进因子中，筛选出蔗糖、乳清粉、啤酒和培养基的初始pH值等4个对结果影响显著的因素，它们对L-RB3的生长影响的可信度分别为：99．9％、99．5％、99．9％和99．9％，其概率P均大于99％。选择P>99％的4个因素蔗糖、乳清粉、啤酒和培养基的pH值影响RB3生长的重要因素。作为重要因素，蔗糖、乳清粉、啤酒对菌落数有正效应，而培养基的pH值对菌落数有负效应。3．4．3、通过响应面法建立了回归方程，研究了蔗糖、啤酒、乳清粉浓度和pH之间的关系，实现培养基的优化。响应面分析法确定强化因子的最佳浓度以及最佳的培养基初始pH值为4．309／l蔗糖，64．8ml／1啤酒，7．42酿乳清粉，培养基初始pH值为6．25。在优化培养基中，RB3的菌体浓度达到1．43x109cfu／ral，比优化前的2．77x108cfu／ml提高了5倍多。第撕页共'‘页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文第四章发酵香肠在成熟过程中的菌相、理化及品质特性的变化4．1前言【59-62]发酵香肠是由原料肉和调料填充于肠衣中进行发酵和成熟得到的肉制品，用于香肠的培养发酵的发酵剂包括筛选的乳酸菌、非致病性凝固素酶阴性的葡萄球菌和微球菌、酵母菌和霉菌，它们提高了最终产品的质量与安全性，规范了其生产过程。在中式混合发酵的香肠中，乳酸菌和球菌的混合应用范围比较有限，然而在发酵过程中，用于中式香肠发酵的乳酸菌或者肉糖葡萄球菌以及微球菌都能提高产品的质量。乳酸菌产生的乳酸和抗菌素能够降低肉的酸度和抑制病原体以及其它致病菌的生长，从而稳定产品的微生态平衡。另外在香肠的发酵过程中用凝固素酶阴性的葡萄球菌和微球菌作为发酵剂不仅能够提高产品的稳定性，而且还能够去除由乳酸菌产生的过氧化氢所带来的颜色不足问题。总体上来说，目前很少有报道关于混合发酵剂中式发酵香肠中微生物、理化指标和感官品质的变化，本研究分别对不同发酵剂生产的四种发酵香肠(分别以CK、SI、SII、SⅢ表示)在成熟过程中的三大类微生物群，即细菌总数、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌、理化指标以及感官品质的变化规律进行了研究。通过对这些变化的研究，从而有利于改进其加工工艺，降低生产成本和制造高质量的产品。4．2实验材料与方法4．2．1发酵剂菌种来源植物乳杆菌(L-RB3)、德氏乳杆菌(L-RFxl)以上菌种由前面分离鉴定所得。肉糖葡萄球菌(S．ALx3)、变异微球菌(M-AFx5)由石河子大学食品学院畜产品实验室提供。4．2．2发酵香肠的生产4．2．2．1发酵剂的接种|为106cfu／gI“。从ⅫRs营养培养基上各取L-RB3和L-RFxl两株菌的单菌落转移到5ml的肉汤MRS培养基中，在30℃培养18．24h，菌体通过冷冻离心机在4"0条件下转速控制在3000rpm，5分钟离心收集菌体，然后在用无菌的去离子水进行冲洗。同理，从MSA营养培养基上各取S-ALx3和M-AFx5两株菌的单菌落转移到5ml的MSA培养基中，在30℃培养24-30h，菌体通过冷冻离心机在4"C条件下转速控制在3000rpm，5分钟离心收集菌体，然后在用无菌的去离子水进行冲洗。最终，菌体的浓度用无菌去离子水调节到106cfu／ml。4．2．2．2发酵香肠的制备香肠的制作按下面所描述的方法制作，四种不同的中式发酵香肠生产如下所示：SI接种德氏乳杆菌L-RFxl、肉糖葡萄球菌S-ALx3和变异微球菌M-AFx5；SII接种于植物乳杆菌L-RB3、肉糖葡萄球菌S．ALx3和变异微球菌M—AFx5；Sm接种于德氏乳杆菌L-RFxl、植物乳杆菌L-RB3、肉糖葡萄球菌S-ALx3、变异微球菌M．AFx5；CK不接发酵剂。对四种产品在成熟过程中的微生物和理化变化进行比较分析，从而为发酵剂的应用前景做出第”页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响客观的评价。新鲜的猪瘦肉和后背脂肪购买于当地市场，香肠制作的加工成分(表4-1)和工序(图4．1)四种样品中是一样的，如上所示：表4—1成分表新鲜无骨猪瘦肉和后背脂肪(70：30)!坐!：!鲤!i鳖i磐望ii!!垒i成分g／1009肉腌制4"C白胡椒粉O．08l五香粉0．10混合成分与发酵剂味精0．08J辣椒0．10填充于天然肠衣生姜粉O．08l酒1．0发酵(22"(2，3天，RI-I：90～95％)食盐3l亚硝酸盐0．010第一阶段干燥(16℃，7天。RH：S0～85％)糖2．0l磷酸盐0．2最终干燥(12"C，18天，RI-I：70～75％)图4-1发酵中式香肠的生产流程!尘±!生!!!宝皇竺!!型!塑!壁!量!坐苎塑塑壁4．2．3取样与样品处理在发酵香肠灌肠后的第0，3，7，14，21和28天(终产品)分别取香肠一根，在无菌条件下取样品259，加入2259无菌蛋白胨液(含1％吐温80，O．85％NaCl)，均质1—2分钟。然后取lml加入到9mlO．1％无菌蛋白胨溶液中，即成10。稀释度，根据需要再依次制成不同的稀释度。剩余的样品马上进行理化分析及品质特性分析所用。4．2．3．1微生物分析不同的菌群分别采用不同的选择性培养基进行分离和计数。采用稀释平板法，于MRS培养基上30℃，48h测定乳酸细菌；PCA培养基上30℃，48h测定细菌总数；MSA培养基上30℃，48～72h测定微球菌和葡萄球菌。各微生物的测定数据均以107cfu／g的形式报告。4．2．3．2理化分析pH值测定：取肉样lOg,捣碎后加90ml蒸馏水，浸提20min后，滤取上液用酸度计测定。(张华，2001)。水分活度测定：水分活度仪。氨基酸的测定：电位滴定法。蛋白质的测定：微量凯氏定氮法。亚硝酸盐残留测定：盐酸奈乙二胺法(按GB5009．33．86执行)．理化分析的实验方案来源于食品分析指导书。4．2．3．3品质分析4．2．3．3．1质构分析(TPA)164]对质构的剖面分析用通用的TA．xr2i质构仪进行分析(Bourne。1978)，样品切成lxlxlcm3的小块，用50mm的圆桶进行两次压缩至原来高度的50％，质构分析曲线记纂鲳页共7‘页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文录的压缩速度和记录速度控制在5mm／s，评价指标有：硬度、弹性、内聚性、粘性、弹力、咀嚼性和胶粘性。TPA分析的定义和计算如先前Raieta1．(2005)所描述的那样，每一个样品的硬度、咀嚼性、黏性、弹性、内聚性、胶粘性和弹力由质构分析曲线图进行计算所得。4．2．3．3．2色泽的评价扣5I颜色的测量采用测色色差仪(WSC．S)，测量的样品切成8mm直径大小的切片进行测量，色差计测量的指标有：(L：亮度；a红度；b黄度)。四个样品中分别取每个样品的两个切片，在切片表面的中央进行5次测量，可以得到其色差值。4．2．3．3．3感官评定166-671感官评定采用不接发酵剂的控制组与接种发酵剂的几组进行比较评价，采用定量描述分析的方法进行评价。每一组抽出两根发酵香肠由挑选并经过训练的几名人员进行瘦肉色泽、脂肪颜色、组织状态、硬度、酸度、滋味、盐度、风味和总体接受性进行评价。评价的分值控制在l到9分，以不接发酵剂的香肠定义参考分数为5分，每一个样品的最低值为1分，最高值为9分。⋯裹牝喜官评定裹Tab4-2thetableofsensoryevaluation4．2．4数据统计分析采用统计软件SAS9．0版中显著性检验、方差分析、相关分析等程序对所得数据进行统计分析，数据表示采用平均值±标准差。4．3结果与分析4．3．1微生物分析第39页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响图牝．四种发酵香肠成熟过程中微生物的变化Fig4-2．MicrobialchangesinfourChinesefermentedsausagesduringnpemng从图4．2可以看出，四种中式发酵香肠在成熟过程中的微生物变化趋势是相似的，都是经历了先上升后下降的过程，但达到最大值的时间不同，这与国内外许多学者研究的结果是一致的【¨一引。由图牝可以很明显地看出乳酸菌是发酵香肠生产中的优势菌，乳酸菌的数量在发酵香肠的整个成熟过程中远远高于肉糖葡萄球菌和微球菌【叫。可以看出乳酸菌的变化趋势为：在发酵阶段，乳酸菌迅速生长繁殖，接种发酵剂的三种发酵香肠的乳酸菌在3天内都超过了108cfu／g，在一周内乳酸菌的数量都基本上达到最大值。然后维持在比较稳定的水平，保持在lOScfu／g以I"，在成熟的后期，即14天以后，乳酸菌呈下降的趋势，终产品中乳酸菌的数量为108cfi垤左右【70J。接种发酵剂的后三种发酵香肠中乳酸菌的数量在发酵和成熟干燥的前期很接近细菌总数，在成熟干燥的后期，接种发酵剂的发酵香肠上MRS上的菌落数超过了PCA上的菌落数，而CK组的乳酸菌明显的比菌落总数低。在发酵阶段由于生产最初水分含量高，营养成分充足，有利于菌的生长。由于接种了乳酸菌和肉糖葡萄球菌以及微球菌，在成熟的前期致使细菌数量大幅下降，到了成熟干燥的后期，由于乳酸菌的消亡，细菌总数也经历了一个缓慢的消亡过程。从表4．3可以看到，菌落总数的变化无论是样品之间，还是不同的日期之间都有明显的差异(P<第钟页共76页 2007届石河予大学硕士研究生毕业论文0．05)。此时有两方面的原因：一是因为在发酵的不同时期，植物乳杆菌(L-RB3)和德氏乳杆菌(L-RFxl)产生的酸和抗菌素物质抑制了细菌总数的生长，由于乳酸菌的生长受多种因素的影响，因此细菌总数也表现出较大的差异性；另一原因是由于各个对照组接种的微生物不一样，产生的酸和抑菌物质不一样，从而也就导致了细菌总数的差异性(Raieta1．，2005)。表4-3四种发酵香肠成熟过程中微生物的变化(cfu／g)Tab4-3．MicrobialchangesinfourChinesefermentedsausagesduringnpemg(cfu／g)培养基时间(天)CkSISIISIII31．33：±0．68×10sc1．25：￡0．07x109b1．6i'0．12x109a1．7：￡-0．05x109aPCA73·05观20x10．sa2·95-士-0·8x10tSa1．88：￡-0·075xlORSb1．27i0·09xl—08c141．25：￡-0．1X10+c2．90-1-0．2x10～5．2-*0．25x10～9，5士2，5x10'd2l7．80"I-0．7xlO。7b2．15：￡-0．05×10sa2．6士O．10xlO'a8．0-a：3．O×107b285．65士I．75x107c9．4i-0．9xt0'a7．3：￡-0．60x107bc7．95士1．05x107ab01．70-土0．2x106ab1．55-士0．45x106b1．6i-0．20x106b2．15i-0．35x106a31．07：￡0．04×10Sd1．28-士-0．1lxl08c3士0．25x108a1．9-土0．20xlOab⋯71．35-1"0．25xlOSd3．04：t-0．155x108c9．4-士1．9x108b1．58-4-0．08x109a脚148．00．a：1．5×to,c5．0匀由．45×to+a4．75士o．65×108a2．3l士0．365×10sb211．45i-0．2x107c2．35-I-0．15x108a1．8-40．60×lOSb2．3i-0．30x108a281．15-I-0．35xlOTd1．65士0．20x108c1A5-'±0．15x108b1．85-I-0．20x10Sa02．15-2--0．35×106a1．65-I-0．20xlOeb1．65-I-0．15x106b2．2．士o．40x106a32．00士0．12x107b1．50-'t0．10x107c8．0士1-00x107a1．3士-0．25x107c⋯．74．15-i-0．25xlOeb4．m=o．20x10t'b5．5士1．1xlO％2．4-4-0．25x107a““141．35-士-0．15x10％1．3士0．30x106b1．45-'士0．10x106b1．3：t-O．05xlOTa216．1i-O．30x10‰9．3士I．7x105ab5．38．士0．125xl旷c5．5士0．50x106a282．05i-0．1x105C3．35：￡0．35×105b3．15-士0．85x105d2．&印．80x106a注：1、以上为三个平皿上的菌落数以及它们的标准差。2、S．I表示同一取样时间的两种样品的水平显著性。S．n表示不显著#’显著(p0．05)。发酵香肠在成熟后期pH值的回升，可能是由于肉糖葡萄球菌和微球菌或肉组织中的酶类通常具有较强的水解蛋白质的能力，肉糖葡萄球菌和微球菌以及组织酶水解蛋白质产生游离氨基酸，氨基酸可进一步被降解为碱性的氨和胺类物质。4．3．2．2Aw值的分析由图4-4可知，在生产发酵过程中，发酵香肠的水分活度是逐渐下降的，其下降的速度不是很明显Q>0．05)。最初水分活度为0．960，发酵完成后，降为0．940左右，干燥完成到达0．810左右，低的水分活度能够抑制大量的有害微生物的生长。加工前3天内产品的水分活度变化不显著，这是由于这一阶段生产环境的相对湿度较高，在900,4以上。这时产品的干燥速率主要由表面水分的蒸发速率所决定的，大量游离水的存在导致了产品的干燥较慢。另一个次要的原因是微生物的迅速生长繁殖还会发酵碳水化合物产生部分水。四种香肠经过一段时间之后，生产环境的相对湿度降低到85％左右，大部分游离水散失，此时产品的干燥速率主要决定向于产品内部水分外的扩散，因而水分活度快速下降，尤其是没有接种的ck组下降的速度比较快，这与Brunaeta1．(2000)研究结果一致。从方差分析来看，这四组发酵香肠的水分活度变化具有明显的显著性(p<0．01)，这可第鸵页共76页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文能与接种的微生物以及原辅料的种类等有关，这需要做进一步的研究与讨论。4．3．2．3总氮的分析发酵香肠在成熟过程总氮的变化见图4．5。从图中可以看出，SI、SII和SIII这三组发酵香肠在发酵过程中的总氮含量是呈先上升后下降的变化趋势，而不接菌种的ck组却没有如此的变化。这可能在发酵过程中接种发酵剂的香肠中蛋白质还没有降解，由于微生物的作用，产生了一些诸如水溶性氮，非蛋白氮，磷钨酸溶性氮，硫代水杨酸溶性氮和总挥发性氮的增加，而没有接种的ck组产生的这些物质比较少，因此变化不明显。因此可以推测蛋白质的降解是在香肠的成熟阶段进行的，这与国内外的许多学者所得出的结果是一致的，但是有一些学者认为当水分含量达N40％以下，蛋白质就不再进行降解，具体原因有待进一步的研究与讨论。在发酵香肠的成熟过程中总氮的含量一直呈上升的趋势，四种产品中最终总氮的含量分别为2．541％、2．369％、2．154％和2．359％。因此，发酵香肠在成熟过程中总氮的变化是由蛋白质的降解和微生物的代谢产生的一些氮类化合物引起的，四组发酵香肠中总氮的变化具有明显的差异显著性(p<0．01)由此我们可得出结论，发酵香肠中最终总氮含量取决于微生物的种类以及其分解能力。这与许多学者所研究的一样(Hughes，2002；Rai。2005)，但与中国农业大学的沈清武(2005)所讲的总氮的增加是由于失重所引起的有点不一致，具体情况有待进一步的研究考证。4．3．2．4游离氨基酸的分析发酵香肠在发酵期间，蛋白质发生降解产生游离氨基酸、多肽、肽等小分子物质，这些物质可以通过自身促进香肠的风味形成，又可以作为底物进一步产生风味化合物。游离氨基酸的高低决定了发酵香肠风味好坏的标志之一。弧由一图4-5四种发酵香肠成熟过程中总氮的变化图4_6四种发酵香肠成熟过程中氨基酸的变化Fig4-5．TotalnitrogenchangesinfourChine8@Fig4-6．AminoacidchangesinfourChinesefermentedsausagesduringripeningfermentedsausagesduringnpening从图4—6可以看出，游离氨基酸的变化无论是在发酵阶段还是在成熟阶段，都是一直在增长，并且其增长的显著性比较明显(p<0．01)，SI、SU与ck相比，游离氨基酸都有所提高，Sm的提高变化最明显，最后达到了196．87rag／1009，与ck组相比，其游离第43页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响氨基酸含量增加速度比较大(p<0．01)。可以认为，发酵对蛋白质的分解有一定的影响，而蛋白质降解生成风味物质主要在成熟阶段完成，本研究结果与Beriaineta1．，(2000)等以及江南大学夏文水等研究结论基本一致。具体是哪一种氨基酸变化比较明显，需做进一步的研究，目前普遍认为是苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸这几种氨基酸变化比较明显(po．05)。微生物的生长繁殖及乳酸菌的发酵作用，引起TPA最大的变化是发酵香肠硬度、粘性以及咀嚼性的变化，有微生物生长繁殖的三个处理的硬度值、粘性值以及咀嚼性值远远大于没有加入发酵剂的CK组，它们的硬度是空白组的两倍左右，植物乳杆菌和德氏乳杆菌的混合加入更能能提高发酵香肠的硬度、咀嚼性和粘性。在四个处理中，其中以四种菌混合发酵时的硬度最大，为104．9239，SI组和SII组发酵香肠次之，空白组的硬度最小，只有42．46679。微生物的生长繁殖同时能显著改变发酵香肠的咀嚼性和粘性，不同处理咀嚼性和粘性的变化与硬度一致，以SHI组处理的咀嚼性和粘性值最大，分别为5．87489xmm和10．51339，CK组的咀嚼性和粘性值最小，分别为0．52849xmm和2．179。由L-RB3、LRFx卜S-ALx3和M．AFx5混合培养发酵产生过量的酸(pH4．74)导致胶原纤维蛋白变性，从而使肌肉快速的干燥，增加了香肠的硬度。中式香肠与其它香肠相比，多汁性和硬度比较低。在原料配料中，瘦肉的粗糙程度和脂肪颗粒的大小对中式香肠的坚硬质构有明显的效果。这种类型的质构特征也与占主导地位的微生物分解蛋白质的程度有很大的关系。4．3．3．2色泽分析结果表4．7发酵剂对色泽的影响Tab4．7Theobjectivecolorme∞urementonday28样品LAbSI57．668-‘_-5．15308a13．655：t：0．47395出13．94-a：2．7695。SII56．9725+2．8635814．8975士1．07662a16．425j：1．2376aSill52．2825d：6．35143a16．075：：1：3．46253。14．07士2．221矿显著性S．n+S．n注；1、S．n表示不显著；’显著(po．05)。然而，没有接种发酵剂的香肠的a值与其它三组相比明显的比较低(po．05)。因此我们可以得出发酵剂对发酵香肠色泽最显著的影响是S-ALx3和M．AFx5两种菌能提高发酵香肠的红度值(a值)。S-ALx3和M-AFx5能分泌硝酸盐还原酶，硝酸盐还原酶还原硝酸盐成亚硝酸盐，亚硝酸盐再分解产生一氧化氮，一氧化氮与肌红色素作用，产生亚硝基肌红蛋白(nitrosomyoglobin)，从而促进腌制肉色的形成。同时S-ALx3和M-AFx5是接触酶阳性的细菌，它们能在发酵香肠中产生过氧化氢酶，分解乳酸菌及其它一些G+菌产生的H202，从而保证亚硝酸盐的发色作用。发酵香肠的红色深浅是影响发酵香肠感官品质的第撕页共7‘页 2007届石河子大学磋士研究生毕业论文一个非常重要的指标，从这点出发，S．ALx3和M-AFx5能提高发酵香肠的感官品质。S-ALx3和M-AFx5的加入对L值和b值影响不是很大，没有明显的显著差异性。这可能是S-ALx3和M-AFx5的硝酸盐还原酶的降解能力以及低的pH值共同影响的结果，对发酵香肠色泽影响差异显著性的可能是香肠的截面，这些归结于中式香肠中肉的异型混合发酵、肌肉、脂肪、硝酸盐、成分的多样性以及肉的不均匀性和脂肪颗粒大小对香肠截面的影响。在对发酵香肠的色泽评价中，发现单纯测定产品的红度值(a值)并不能完全反映人肉眼的观察结果。这是因为黄度值(b值)的不同，对红色会造成很大的影响。因此大多数学者采用a／b值来比较红色，认为此数据更能贴切地反映出入们对红色的感官评价【74-751。a／b值越大，表现出的红色越鲜艳，可接受程度越高。由于本实验的黄度值没有明显的变化(p>o．05)，因此主要考虑的是红度值。4．3．3．3感官分析结果表4．8四种发酵香肠的平均风昧值Tab4-8TheMeansensoryscoreoffourfermentedsausages指标CKSISIISM11．1瘦肉色泽5．13：￡-0．3006．12士o．11。6．54i-0．08。7．23i-0．388”咀嚼性5．18士o．1806．84士-0．4107．06士-0．3147．39"士-0．154”组织状态5．65士0．6507．44i-0．98a7．23士-0．8446．89"士1．238～”’硬度5．66士0．36‘6．51士-0．2106．36d：1．56b7．19"J：1．544”酸度4．35-士0．35。5．58士o．45。6．68-+0．68a6．75士-0．344”盐度6．32-土'0．25。6．49-：-0．78a6．27土1．矿6．38士-0．891S．n气味4．65-x-0．2506．75：t-0．8346．43i0．64a6．68：￡-0．564”滋味5．45i-0．68。6．45t'-0．9406．12-+0．56b6．68-+0．324o‘可接受程度5．67i-0．25。7．11土O．41。6．93i=()．32b7．35士-0．564”注；I、S．n表示不显著：’显著p<0．05：”极显著p<0．01。2，数据分析采用SAS(StatisticalAnalysisSystem2004)统计软件^●lo、，^过程进行．3、数值表示形式为平均值±标准差，同行上标不同者差异显著．从感官评定结果来看(见表4．8)，植物乳杆菌和德氏乳杆菌作为发酵剂的加入确实提高了发酵香肠的酸味，单一和混合乳酸菌发酵剂生产的两种产品(SI和SII)的酸味都要明显高于自然发酵的香肠CK。另外，与自然发酵的CK相比，在SI中酸味的浓度要低，而SII和SIII的气味则更迎合感官评定小组的嗜好，这是因为植物乳杆菌具有较强的产酸性能，与前面所研究的结果是一致的。从结果可以看出，感官评定的盐度在整个样品中都没有表现出差异显著性Q>o．05)，尽管接种发酵剂的样品中的盐度比不接菌种的香肠要低。不接菌种的CK组香肠在色泽、咀嚼性、组织状态、硬度、酸度、风味以及总体接受性方面都明显的比较低(pFo．oI(20，15)_3．36，表明模型方程极显著，不同处理间的差异极显著口Fo．01(20，15)-3．36，表明模型方程极显著，不同处理问的差异极显著(PFo．ol(20，15)_3．36，表明模型方程极显著，不同处理间的差异具有显著性口ldl>lAwl>INaCll>lSug酬可知，温度t和时间d对乳酸菌的变化影响较大，且都为负效应。5．3．2．2单因素效应分析将回归模型中5个因素其中4个固定在零水平，可得单因素模型：NaCl：X=7．32—0．012xNaCl+O．30NaCl202y／ONaCl2=-0．012+0．60NaClAw：K=7．32+0．15×4w+0．22Aw202y／0Aw2=0．15+0．44Awt：五=7．32—0．24xt+0．27t202y／&2=-0．24+0．54td：艺=7．32—0．22×d+0．29d202y／&12=．o．22+0．58dSugar：巧=7．32+O．03xSugar+O．41Sugar2a2y／OSugar2=O．03+0．82Sugar单因素模型边际效应分析为求各因素回归方程的极值点，令dy／啮=O，(j=l，2，3，4，5,Zj=NaCI，Aw,t,d,Sugar)得：z1句．02，z2’=-0．34，Z3*=0．44，z4’=o．38，Z5。=-0．04(编码值)，分别将z的编码值代入单因子效应方程，根据单因子效应值作图，得到单因子效应曲线图5．1。第弱页共7‘荑 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文图5-1乳酸菌的单因素效应Fig5-1．Singlefactoreffectofenvironmentfactors图5-2各因素的边际效应Fig5-2．Theboundaryeffectofeveryfactor由图5，l可以看出，五条单因子效应曲线在编码值为零左右时都基本上达到了最小值。当编码值小于零时，五种环境因子与发酵香肠中的乳酸菌呈负效应，即随着五种环境因子变量的不断增加，乳酸菌呈现出一个下降的过程，数量逐渐减少；当编码值大于零时，五种环境因子的变化与乳酸菌的变化呈现出正效应，即随着五种环境因子盐浓度、发酵时间、发酵温度、水分活度和糖浓度的不断增加，乳酸菌不断增加。对单因子效应方程求一阶偏导数，得到单因子的边际效应【791。单因子效应方程反映了发酵香肠发酵过程中乳酸茵随不同环境因子编码值(浓度水平)的变化速率。糖浓度的曲线斜率最大，说明糖浓度的使用量的变化量在五种环境因子中对乳酸菌的变化的影响最大，发酵时间、发酵温度和盐浓度次之，随水分活度的变化影响最小。5．3．2．3乳酸菌的交互作用，=t嚣=。撩=。：嚣一⋯图5-3．响应曲面图显示当其它几个因素保持固定时时间与温度对乳酸菌的影响．Fig5-3．Responsesurfaceplotshowingtheeffectoftandd013lacu'caddbacteriaWhilerestfactorswerekeptconstant．由回归方程的回归方程显著系数显著性检验结果可知，发酵时间和发酵温度以及发酵温度和糖浓度之间存在着显著的交互效应。由等值线图也可以看出两者之间的交互作用是不是具有显著性，具有椭圆性的等值线图说明两者之间的交互作用对乳酸菌的影响比较大，具有圆形的等值线图说明两者之间的交互作用对乳酸菌的影响比较小【“⋯】。对回归方程采用降维分析方法，将另外三个因子固定在零水平，得出两因子的交互效应方第55页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响程，用SAS9．0编程作如下图。由图5．3可以看出，二维等值线图揭示了交互作用发酵时间与发酵温度之间的作用规律，图中等值线比较密的方向对应的坐标所表示的因素为交互作用的主要方面。当发酵时间和发酵温度都处于(O．1)的编码值时，乳酸菌基本上处于一个比较稳定的状态，此时发酵时间与发酵温度之间的交互作用对乳酸菌的变化不存在明显的协同增效作用；当发酵时间和发酵温度都处于编码值比较大时，乳酸菌都达到最大值，他们之间此时有明显的协同增效作用。从响应曲面图中可以看出，在发酵的初期内，当发酵温度逐渐降低时，乳酸菌的数量急剧下降，下降速度比较快，这是因为加入的发酵剂(L-RB3和L-RFxl)具有较高的生长温度，低温不适合其大量生长。当温度开始逐渐升高时，乳酸菌的数量也开始慢慢的增加，一方面由于嗜冷乳酸菌(如米酒乳杆菌)生长加剧了乳酸菌的数量增加；另一方面可能是由于温度的升高促进了加入乳酸菌的生长。在发酵的后期内，温度的升高对乳酸菌的生长起到了一个抑制的作用，这是因为温度的升高有利于其它菌的生长消耗了大量的营养物质，导致乳酸菌的数量逐渐下降。7：：一：=荔=：It篇==．：盘⋯‘图5-4．响应曲面图显示当其它几个因素保持固定时温度与糖浓度对乳酸菌的影响Fig5-4．ResponseSUtfageplotshowingtheeffectofdandsugarOnlact／cacidbacteriaWhilerestfactorsWCI'ekeptconstanL由图5-4可以看出，二维等值线图揭示了交互作用发酵时间与糖浓度之间的作用规律，发酵时间和糖浓度的交互作用与发酵温度和发酵时间的交互作用对乳酸菌的影响规律基本是一致的。在糖浓度比较低时，乳酸菌随着发酵温度的升高而逐渐升高，在发酵温度的编码值为最大时，此时的乳酸菌的数量也达到了最大。在糖浓度比较高时，乳酸菌的数量随着温度的升高而逐渐下降。在糖浓度低时，乳酸菌在低温下不利于生长，当温度升高时，接入的乳酸菌能够大量的繁殖生长，抑制了许多微生物的生长。在糖浓度比较高时，由于许多菌受到糖的抑制，从而此时的微生态大多是有益的乳酸菌，当温度逐渐升高时，乳酸菌在经历了生长期以后回慢慢的转向灭亡期，乳酸菌的数量逐渐下降。无论在发酵温度比较低还是发酵温度比较高时，乳酸菌的数量随着糖浓度的增加呈现出先下降而后上升的一个过程。因为在发酵温度比较低时，随着糖浓度的增加，会产生大量的酸，抑制了大量微生物的生长，从而有利于乳酸菌的生长。5．3．3发酵过程中环境因子对球菌变化的影响5．3．3．1主效应分析纂靳荑共7‘页 2007届石河子大学硬士研究生毕业论文由于设计中各因素均经无量纲性编码处理，且各一次项回归系数之间，各交互项之间以及平方项的回归系数之间都是不相关的，因此可以由回归系数绝对值的大小来直接比较各因素一次项对发酵香肠发酵成熟过程中球菌的变化的影响，这里ldl>lAwl>|NaCll>nI>lSu酬可知，水分活度Aw和时间d对球菌的变化影响较大，水分活度为负效应，发酵时间为正效应。5．3．3．2单因素效应分析由5．3．2．2同理可以得出球菌的单因子效应曲线和边际效应图。由图5-5可以看出，五条单因子效应曲线在编码值为0．5左右时都基本上达到了最小值。当编码值小于O．5时，五种环境因子与发酵香肠中的球菌呈负效应，即随着五种环境因子变量的不断增加，球菌呈现出一个下降的过程，数量逐渐减少；当编码值大于0．5时，五种环境因子的变化与球菌的变化呈现出正效应，即随着五种环境因子盐浓度、发酵时间、发酵温度、水分活度和糖浓度的编码值不断增加，球菌数量不断增加。图5-5．球菌的单因素效应图图5-6各因素的边际效应Fig5-5·SinglefactoreffectofmicrococcusFig5-6．Thebotmdaryeffectofeveryfactor由边际效应图5．6可以看出，盐浓度的斜率最大，水分活度和发酵温度的斜率基本一致，发酵时间和糖浓度最小。因此球菌的变化随盐浓度变化的速率最快，发酵时间、发酵温度和水分活度次之，随糖浓度的变化最慢。5．3．3．3球菌的交互作用分析由回归方程的回归方程显著系数显著性检验结果可知，发酵时间和糖浓度以及水分活度和糖浓度之间存在着显著的交互效应，用SAS9．0编程作如下图。由图5．7可以看出，二维等值线图揭示了交互作用水分活度与糖浓度之间的作用规律，图中等值线比较密的方向对应的坐标所表示的因素为交互作用的主要方面。当水分活度和糖浓度都处于(x，x)这样的编码值时，球菌基本上处于一个比较稳定的状态，此时水分活度与糖浓度之间的交互作用对葡萄球菌的变化不存在明显的协同增效作用；当水分活度与糖浓度分别处于编码值比较大时，球菌的数量达到最大值，他们之间此时有明显的协同增效作用。第57页共76页 发酵香肠菌种的缔选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响2=}搿=：：：：=t嚣一～图5-7．响应曲面图显示当其它几个因素保持固定时水分活度与糖浓度对球菌的影响Fig5-7．ResponsesurfaceplotshowingtheeffectofAwandSugaronmicrococcusWhilerestfactorswerekeptconstant．从图5．7的曲线图可以看出，要增加球菌的数量，Sugar的浓度应控制在2．5-4．O％之间，浓度过低会减少球菌的数量；Aw值应控制在0．96-0．99，过低也会减少球菌的数量。同时也可以看出，球菌的数量随着Sugar的浓度和Aw值的增大而呈现出一个增大的趋势。当Sugar的浓度在l-3％之间和Aw值为0．93-0．97时，其对球菌的数量变化没有明显的影响，显然在Sugar的浓度比较高和水分活度比较大时，球菌的数量比较多，这是因为随着糖浓度的增加，乳酸菌产生大量的酸抑制大量微生物的生长，从而为球菌的生长提供了比较充分的条件。从图中可以看出，球菌的变化与水分活度的变化呈现出一致性，即当水分活度变大时，球菌的数量也随之增加。这是因为球菌主要在肉的表面生长，而水分活度的变化首先发生在肉的表面，因此水分活度的变化对球菌的变化影响比较明显。‘-￡篇=}拳一}错⋯图5—8．响应曲面图显示当其它几个因素保持固定时时间与糖浓度对球菌的影响Fig5-8．Re$pon目gsurfaceplotshowingtheeffectofdandSugaronm／crococcusWhilerestfactorswgrekeptconstant．由图5．8可以看出，当发酵时间和糖浓度都处于(x，-X)这样的编码值时，球菌基本上处于一个比较稳定的状态，此时发酵时间与糖浓度之间的交互作用对球菌的变化不存在明显的协同增效作用；当发酵时间和糖浓度分别处于编码值比较大时，球菌达到最大值，他们之间此时有明显的协同增效作用。从图5-8的曲线图可以看出，要使球菌的数量达到最大，Sugar的浓度和d值要么控制在比较低的情况下，要么都控制在编码值比较高的情况下，一个过高一个过低都会影响到球菌的数量。同时也可以看出，在糖浓度比较低时，球菌的数量随着发酵时间的增加而呈现出一个下降的过程，这是因为随着发酵时间的进行，营养物质的逐渐消耗以及微生态的相互作用导致了球菌的逐渐减少。在糖浓度比较高时，球菌的数量随着发酵纂黯页共％荑 20e7届石河子大学硕士研究生毕业论文时间的增加而呈现出一个上升的过程，这是因为发酵过程中的微生物主要是乳酸菌，糖浓度的增加，预示着pH值急剧下降，从而影响到发酵香肠中其它微生物的生长，从而为球菌的大量繁殖提供了有利的条件。当温度比较低时，球菌的数量随着Sugar的浓度的增加而呈现出一个明显下降的过程，这是因为温度比较低时，不利于乳酸菌的大量生长，从而为其它菌的生长创造了有利的条件，这些菌与球菌相互竞争，导致了球菌的不利生长。在当温度比较高时，球菌的数量随着Sugar的浓度的增加而呈现出～个明显上升的过程，这是因为温度比较高时，有利于乳酸菌的大量生长(菌种筛选时乳酸菌在高温时生长比较良好，而在低温下生长不是很好)，从而抑制了大量菌的生长，有利于球菌的快速生长。5．3．4发酵过程中环境因子对菌落总数变化的影响5．3．4．1主效应分析由于设计中各因素均经无量纲性编码处理，且各一次项回归系数之间，各交互项之间以及平方项的回归系数之间都是不相关的，因此可以由回归系数绝对值的大小来直接比较各因素一次项对发酵香肠发酵成熟过程中菌落总数的变化的影响，这里INaClpIdl>IAⅣJ>KI>IsugarI可知，。NaCl和时间d对菌落总数的变化影响较大，且都为负效应。5．3．4．2单因素效应分析图5-9．菌落总数的单因素效应图5．10，各因素的边际效应Fi95-9．Single自_ctoreffectofTBCFig5．10．Theboundaryeffectofeve'I'yfiactor由上面同理可以做出菌落总数的单因子曲线图和边际效应图如图5．9和5．10。由图5-9可以看出，盐浓度和糖浓度两种环境因子对菌落总数的影响呈显出一条下降的曲线，也即是说菌落总数的变化与盐浓度和糖浓度呈现负效应，当盐浓度和糖浓度增加的时候，菌落总数逐渐减少，这也是盐和糖能保藏食品的原因。当编码值小于零时，发酵温度环境因子与发酵香肠中的菌落总数呈负效应，即随着环境因子变量的不断增加，菌落总数呈现出一个下降的过程，数量逐渐减少；当编码值大于零时，发酵温度的变化与菌落总数的变化呈现出正效应，即随着环境因子发酵时间的不断增加，菌落总数不断增加。水分活度和发酵时间两条单因子效应曲线与发酵温度单因子曲线表现出相反的变化趋势。第驺页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中徽生物的影响菌落总数随着盐浓度的增加和发酵温度的升高逐渐减少，同时随着水分活度的增加、发酵时间的延长以及糖浓度的增加而升高，它们之间的混合作用增强。因此，在研究发酵香肠发酵过程中菌落总数的变化趋势时，并不一定是某单一环境因子影响最大，而是多个环境因子共同作用的结果。对单因子效应方程求一阶偏导数，得到单因子的边际效应图如图5．10所示。单因子边际效应图反映了发酵香肠发酵过程中菌落总数随不同环境因子编码值(浓度水平)的变化速率。由单因子边际效应曲线可以看出，盐浓度和发酵温度的睦线斜率最大，说明盐浓度的使用量的变化量在五种环境因子中对菌落总数变化速度的影响最大。糖浓度的曲线斜率最小，说明糖浓度的变化最菌落总数变化的速率影响不是很大。食盐浓度对总数的生态效应最强，因为菌落总数中许多微生物食盐敏感性，随着盐浓度的增加，菌落总数明显下这也是腌制食物保藏的基本原理。5．3．4．3菌落总数的交互作用分析由表5．3可知，水分活度和盐浓度之间存在着显著的交互效应。本论文选取水分活度和盐浓度以及水分活度和发酵时间之间的交互作用进行分析。用SAS9．0编程作如下图。‘影响图5．12．响应曲面图显示当其它几个因素保持固定水分活度与时间对菌落总数的影响Fig5-12．ResponsesurfaceplotshowingtheeffectofSugaranddonTBCWhilerestfactorswcTekeptconstant．由图5．11二维等值线图可以看出当水分活度和盐浓度都处于低的编码值时，菌落总数此时的数量为最大，此时水分活度与盐浓度之间的交互作用对菌落总数的变化不存在明显的协同增效作用；当水分活度和盐浓度都处于编码值比较大时，菌落总数达到最小值，他们之间此时有明显的协同增效作用。从图5．1l的曲线图可以看出，随着NaCl浓度的增加和Aw的增大，菌落总数的数摹秘页共7‘页 2007届石河子大学硕士研究生毕业论文量呈现出一个下降的趋势。在NaCI浓度比较高和Aw值比较大时，菌落总数比较少。Aw一定时，菌落总数随着NaCl浓度的升高而极速的下降，这是因为菌落总数中有许多不耐盐的菌，它们的生长受到抑制。从等值线图中可以看出对菌落总数有明显作用的是等值线比较密的地方，也就是在NaCl浓度低比较高和Aw值比较小时，这时候它们的变化趋势比较明显，对菌落总数的影响也比较显著。从图5．12的曲面图可以看到，要减少菌落总数的数量，发酵时间越长越好，Aw过低或者时间比较短，都有利于成批菌落总数的生长，这是因为乳酸菌的生长抑制了菌落总数的生长，这与前面以及许多学者得出的结论完全一致。Aw一定时，在发酵的前期菌落总数呈现出一个上升的趋势，这是因为前期营养物质比较丰富，有利于菌的生长；随着发酵时间的进行，菌落总数加速消亡。一方面由于营养物质的不足导致菌落总数的下降；另一方面由于乳酸菌的大量繁殖产生的细菌素抑制了菌落总数的生长，从而降低了菌落总数的数量。二维等值线图揭示了交互作用的变化规律，图中等值线密的地方对应的坐标所表示的因素为交互作用的主要方面。显见，交互作用Aw和d中影响菌落总数数量的是发酵时间，特别是在水分活度比较高时，菌落总数一直表现为下降的趋势。5．4回归方程的应用回归方程分析在食品中有广泛的应用：描述某种现象与其影响因素之间的关系，如产品的变质情况与贮藏温度与时间的关系；将预报因子(自变量)代入根据试验得到的回归方程中，对预报量(因变量)及变化区间进行估计，如用快速货架期试验(ASLT)得到的食品的品质变化模型就可计算货架上食品的品质，预测其货架寿命；通过对回归方程的反函数进行求解，就可以知道为达到某种预定的要求，应采取的措施。从而对产品的质量和安全进行控制。5．4．1生产工艺的优化5．4．1．1发酵香肠新旧工艺感官评定对乳酸细菌的回归方程求偏导可以如下所示：％。=--0．12+0．59NaCI+O．06Aw+0．005t+o．07d+o．16Sugar=0％，=o．15+0．06NaCI+0．44Aw+O．02t+0．17d-0．04Sugar=O％=—o．24+0．006NaCI+0．017Aw+0．55f一0．30d一0．26Sugar=O％=-o．22+0．07NaCI+O．168Aw-0．3t+0．58d+0．1lSugar=O乡幺，=o．03+0．16NaCl一0．04Aw一0．26t+0．1ld+0．41Sugar=o即0．59O．060．0050．07O．160．06O．44O．02O．17—0．040．0060．017O．55一O．30—O．260．070．168—0．30．58O．1l0．16一O．04-0．26O．1l0．4lN4Cl4wtdSugar—O．12O．15一O．24一O．220．03由上面可以得到乳酸细菌的偏导数解，同理可以得到另外两个回归方程的偏导数第6l页共76页 发酵香肠菌种的筛选鉴定及环境因子对其发酵过程中微生物的影响解。根据发酵香肠发酵过程中的微生物变化规律，依据乳酸菌、球菌和菌落总数的偏导数解，确定了发酵香肠的最佳发酵工艺条件为：NaCI：5％：Aw：O．95；发酵成熟温度t：14"C；发酵时间：20d；Sugar：2％。将最佳工艺条件生产的发酵香肠产品与传统工艺生产的香肠产品进行了感官鉴评，各指标的综合得分见表5．7。新工艺发酵20d的产品与传统工艺发酵30d的产品之间，感官鉴评没有显著性差异，新工艺可行。表5—7六种发酵香肠的感官风味值Tab5-7Meansensoryst?,,oreofsixfermentedsausages指标样品l样品2样品3样品4样品5样品6瘦肉色泽7．21±-0．86I7．13士o．35”6．86士o．84”6．23±1．68d6．51±1．oo删6．35土0．32d脂肪颜色6．88．-t：0．39b6．9．7-4-0．55b7．12_44)．0386．37：t：1．08c6．31±-0．35。6．29-±0．51。组织状态7．27：±1．12a7．16：t：0．65‘5．48士o．98。5．89-±1．02b5．64±1．32be5．78=t：1．56be硬度6．52-4-0．79b6．56士o．6506．69M．1矿7．34士-0．68a7．67±1．48a7．58=1：1．02l酸度6．6趾1．31co6．78：t：1．02”7．42--t：0．97I6．44k加．86de6．23-2-045。6．96±0．s6b盐度7．32．±0．94b7．12--L1．050‘7．67±1．15丑6．49x'0．79c6．25±1．0346．31±1．15co气味7．24＆0．8647．28=1：1．13。6．45-±1．ub6．67：t：0．78b6．41±1．12b6．58：t：1．56b滋味5．88-M．舻5．78：t：1．63。5．45-．t：I．32a6．72：t：1．04b6．95士0．98a6．82：t：1．42ab可接受程度6．66：e1．65b6，82±1．4306,46±1．21。7．18M．1537．25±1．7887．27±1．964注：样品l代表lilt艺发酵30天；样品2代表新工艺发酵20天；样品3代表新工艺发酵30天；样品4代表l号样微波加热lmtni样品5代衰2号样微波加热In'fin；样品6代表3号样微波加热lmin．注：1、数值形式为平均值±标准差，同行上标不同者表示具有显著的差异性．2，数据分析采用SAS(StatimicalAnalysisSystem2004)统计软件ANovA过程进行．从表中可以看出：(1)新工艺发酵20d的产品与传统发酵30d的产品，在瘦肉色泽、脂肪颜色、组织状态、硬度、盐度、酸度、香气、滋味及可接受程度等感官指标上没有表现出显著差异，这说明发酵过程的优化，可以改变微生物之间的更迭，特别是加入微生物发酵剂可以缩短发酵周期，改善产品的品质。新工艺发酵20d的产品与传统工艺发酵30d的产品之间，感官鉴评没有显著性差异(P>O．05)，新工艺可行。(2)在感官鉴评的指标体系中，产品的气味和色泽之间的差异达到了极显著水平(P<0．01)。微生物的变化和发酵时间对产品的风味或色泽有巨大影响，这为微生物发酵剂的应用及选定工艺参数提供了依据。(3)优化工艺发酵20d、30d和传统工艺发酵30d的三个产品切片后通过微波炉加热处理后的可接受程度比较高，进行数据的显著性比较分析，结果未见显著性差异，优化工艺大大缩短了生产周期。对于肉食生产企业而言，建立方便、有效的感官评价体系，对开发新产品，降低生产成本，完善生产工艺和开拓市场有重要意义。微生物发酵剂在发酵香肠生产中发挥着重要作用，不同的微生物发酵剂对产品感官性状的贡献不一样。可以从消费者的角度，通过感官评价进行发酵香肠发酵剂的筛选，这方面的工作有待进一步深入研究。5．4．1．2发酵香肠样品测评指标间相互作用关系分析簟n页共7‘夏 2007届石河予大学硬士研究生毕业论文表5—8发酵香肠各测定指标之间相关关系统计分析结果Tab5-8thecorrelationanalysisresultsbe“nmeveryitemsoffermentedsausage本研究所涉及到的各项测定指标并不是孤立的，它们之间一定存在着相互影响、相互作用的关系，为了了解各个指标之间的相关特性，本研究利用SAS9．0系统进行了各指标间的相关关系分析【s2l，结果见表5．8。表5-8相关分析结果显示：脂肪颜色与硬度、滋味、盐度、可接受程度；组织状态与气味；硬度与盐度、滋味；盐度与滋味、可接受程度：气味与可接受程度之间都存在着极显著的相关性(阳O．01)；瘦肉色泽与脂肪颜色、硬度、滋味；硬度与可接受程度之间存在着显著的相关性(P