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《radixin定点突变过表达对hepg2细胞膜转运蛋白bsep的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、201311037Radixin定点突变过表达对HepG2细胞膜转运蛋白BSEP的影响封欣婵，柴进，程英，陈文生（400038重庆，第三军医大学西南医院全军消化病研究所）[摘要]目的构建pcDNA3.1-RDX定点突变真核过表达质粒，研究其在胆汁淤积时对HepG2细胞膜转运蛋白BSEP定位表达的影响。方法从含有RDX野生型质粒中，利用PCR方法钓取RDX野生型基因片段并以野生型为基础进行定点突变，PCR扩增后转入pcDNA3.1载体，其产物转化DH-5α感受态细胞。对长出的单克隆进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分
2、析，比对正确即为构建成功的目的质粒。将目的质粒转染HepG2细胞，经G418筛选构建稳转细胞株。提取各株细胞的总蛋白，检测磷酸化RDX是否影响HepG2细胞膜上转运蛋白BSEP的表达。结果PCR和测序结果均证实pcDNA3.1-RDXWT、pcDNA3.1-RDXT564D、pcDNA3.1-RDXT564A过表达载体构建成功。蛋白免疫印迹表明，与转染pcDNA-3.1-RDX-WT的HepG2相比，转染pcDNA-3.1-T564D的HepG2的BSEP膜蛋白表达量显著增加(P<0.05)，而转染pcDNA-3.1-T564A的HepG
3、2的BSEP膜蛋白表达量有所下降(P>0.05)。结论成功构建了pcDNA3.1-RDXWT、pcDNA3.1-RDXT564D、pcDNA3.1-RDXT564A过表达载体，并证实RDX的磷酸化能增强HepG2细胞膜上BSEP的表达。[关键词]RDX定点突变；载体构建；pcDNA3.1载体；胆盐输出泵[中图法分类号]R34；R575.5；Q291[文献标志码]ATheeffectofradixinphosphorylationonbilesaltexportpumpexpressionofHepG2cellmembraneFengXin
4、chan,ChaiJin,ChengYing,ChenWensheng（DepartmentofGastroenterology,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China）[Abstract]ObjectiveToconstructradixin(RDX)wildtypeandmutantover-expressionvectors,pcDNA3.1-RDXWT,pcDNA3.1-RDXT564D,andpcDNA3.1-RDXT564A,
5、andtostudytheeffectsofRDXphosphorylationonbilesaltexportpump(BSEP)expressionofHepG2cellmembrane.MethodsRDXwildtypegenewasusedastemplatetocarryoutpointmutation,T564DandT564A.AlltargetDNAsweretransferredtopcDNA3.1toconstructthreeover-expressionvectors,pcDNA3.1-RDXWT,pcDNA3.
6、1-RDXT564D,andpcDNA3.1-RDXT564A.DH-5αcompetentcellsweretransformedwiththerecombinantplasmidsforpositivecloneidentification.ThentargetcloneswereusedtotransfectHepG2cellsandstablecelllineswereestablished.WesternblotwasusedtoconfirmtheexpressionofRDX,p-Thr564-RDXandBSEP.Resu
7、ltsAlltherecombinantplasmidswerecorrectlyconstructed.WesternblotresultsdemonstratedthatthecellmembraneBSEPexpressioninHepG2cellstransfectedwithpcDNA3.1-RDXWTwasslightlyhigherthanthatinthecellstransfectedwithpcDNA-3.1-RDXT564A(P>0.05)andsignificantlylowerthanthatinthecells
8、transfectedwithpcDNA3.1-RDXT564D(P<0.05).ConclusionRDXwildtypeandmutantover-expressionvectorsare
