实验三(设计性实验)九龙江水大肠菌群的测定

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1、实验三（设计性实验）九龙江水大肠菌群的测定九龙江水大肠菌群的测定周涛（闽南师范大学生科院食品科学与工程14级）摘要：本文通过多管发酵法测定水源水大肠菌群数量，初步发酵试验检测水源水存在大肠杆菌菌群，平板分离得到单一菌群群落，复发酵试验通过革兰氏染色确定为大肠菌群阳性结果。关键词：九龙江水、大肠菌群、多管发酵法、初步发酵试验、平板分离、复发酵试验、革兰氏染色、DETERMINATIONOFCOLIFORMBACTERIAJIULONGRIVERWATERTaoZhouAbstract:Inthispaper,mu

2、ltipletubefermentationmethoddeterminedbythenumberofcoliformsourcewater,preliminaryfermentationtestsdetectthepreseneeofE.colibacteriasourcewater,flatfloraisolatedsinglecommunit%complexfermentationtestbyGramstainidentifiedascoliformpositiveresults・Keywords:Jiu

3、longRiverwater,coliform,multi-tubefermentationmethod,preliminaryfermentationtests,flatseparated,complexfermentationtest,Gramstain,1材料与方法1.1基本原理多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。1.1.1初步发酵试验（48h，需2天）发酵管内装有乳糖胆盐蛋白腺液体培养基，并倒置一德汉氏小导管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产生酸

4、产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有滉甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。漠甲酚紫还有抑制其它细菌如芽范菌牛长的作用。水样接种于发酵管内，37°C下培养，24h内小套管中有气泡形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为

5、阴性结果。1.1.2平板分离（1天，初发酵2天后做此实验，此实验第2天即可做革染）平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂（EMBagar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群落变成为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可以抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红美蓝染料，在此作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时,该两种染料即结合复合物，使大肠菌群产生与远藤

6、氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的铜绿色深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24h内产酸产气邙日性结果）和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。1.1.3复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性芽砲杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的,最后确定为大肠菌群阳性结果。1.2实验材料和设备：器材：试管、吸头（lml.5ml）、冰箱、量筒、玻棒、烧杯、PH计、培养皿、水浴锅（箱）、培养箱、试剂瓶、电磁炉、显微镜、锥形瓶、接种环、干燥箱、汉德氏管、高压

7、灭菌器、单道移液器、电子分析天平、培养基：乳糖胆盐蛋白月东、伊红美蓝琼脂（EMB）1.3操作步骤（一）多管发酵（大肠菌群的测定）1.3.1水样的采集：用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。1.3.2水样的稀释：将灭菌的三根试管各装9ml的无菌水标上1、2、3各组的记号。充分振荡水样，从中吸取lml于1号试管中，充分振荡即得1：10的稀释液。同理配制1：100及1000稀释液

8、。1.3.3水源水的检查（1）从原水样、1:10、1:100、1：1000的稀释液各吸取lml于4支经过灭菌的装有10m乳糖胆盐蛋白陈液体培养基中，内倒置一德汉氏小导管。（每吸取一次，吸头都要换一次）。（2）将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h,24h未产气的继续培养至48h。记录其稀释液的产气管数，进行复发酵试验。（3）平板分离经24h及48h培养后，将产酸产气的发酵管，分别划线