实验五食品中大肠菌群的测定

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1、实验五食品中大肠菌群的计数参考GB4789．3-20101、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。2、练习并掌握大肠菌群的检验方法 。一、目的2广东科贸职业学院二、原理1、大肠菌群大肠菌群系指一群在37℃、24小时能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。3广东科贸职业学院主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的Ⅲ亚属细菌组成。典型大肠杆菌的IMViC与硫化氢试验结果为++---。4广东科贸职业学院该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为

2、粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每1g（或mL）检样内大肠菌群最可能数MPN（the most probable number-简称MPN）表示2、测定的意义5广东科贸职业学院三 、材料1、食品样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。2、阳性对照菌大肠杆菌6广东科贸职业学院除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、均质器、振荡器、

3、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。3、 仪器设备7广东科贸职业学院月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、1mol/L盐酸（HCI)。4、培养基和试剂8广东科贸职业学院第一法大肠菌群MPN计数法。第二法大肠菌群平板计数法。四、检验方法9广东科贸职业学院试验流程10广东科贸职业学院1、样品的稀释（1）固体和半固体样品称取25g样品，放入盛有225ml磷

4、酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。第一法大肠菌群MPN计数法11广东科贸职业学院（2）液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀液。（3）样品匀液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠

5、（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。12广东科贸职业学院13广东科贸职业学院（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。14广东科贸职业学院（5）、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过

6、程不得超过15min。15广东科贸职业学院每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）,36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。2、初发酵试验16广东科贸职业学院记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。17广东科贸职业学院用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉

7、汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。3、复发酵试验18广东科贸职业学院根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录B)，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告19广东科贸职业学院第二法大肠菌群平板计数法20广东科贸职业学院大肠杆菌0157显色培养基上的菌落21广东科贸职业学院在伊红美兰乳糖琼脂（

8、EMB）上22广东科贸职业学院大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征典型菌落为红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为2-3mm或更大。23广东科贸职业学院大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。24广东科贸职业学院大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征25广东科贸职业学院26广东科贸职业学院试验流程27广东科贸职业学院1、样品的稀释按第一法中的稀释方法进行。28广东科贸职业学