实验四超氧化物歧化酶测定

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1、实验四超氧化物歧化酶测定高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27H实验1超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛含量的测定(操作步骤)1试剂配制1.1磷酸缓冲液(PBS)配制注：配成PBS2000ml,其中1000ml用于A液配制，另1000ml用于酶液制备。1.2其它溶液配制2酶液制备称取植物材料lg,加少许0.05mol/L>pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10ml匀浆。转移至10ml离心试管中，在3000rpm下粗离心1分钟,粗提液再转移

2、至2个5ml离心管中，在冷冻离心机13000g>4°C下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD活性和丙二醛含量的测定。3丙二醛含量测定吸取酶液2ml-加入F液2ml-沸水浴加热15分钟(呈粉红色)一快速冷却->4000rpm下离心5分钟。若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。以F液为参比液,分别在532nm和600nm处测定光密度值。丙二醛含量(nmol•g)=式4V/v-提取液总量(10ml)/测定液用量(2ml)R—反应液总量(4ml)W…植物材料鲜重或干重(g)0.155—丙二醛的摩尔浓

3、度消光系数(^[MDA]=lnmol/ml时,OD532-OD600=0.155)[即(OD532—OD600)/0.155的单位为InmolMDA/ml]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值室温下丙二醛含量(nmol•g-1)=-0.0022+0.039/0.155x4x10/2x1=4.75nmolg-1冷处理下的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值冷处理下丙二醛含量(nmol•g-1)=0.077-0.026/0.155X4

4、X10/2X1=6.58nmol•g-14超氧化物歧化酶活性测定4.1操作及说明(1)按照下表加入各种溶液:试管处理重复编号A液112对照植株（处理1）II22I32胁迫植株（处理2）II42仪器调零液52无酶液（NBT还原100%）62按顺序加入各种溶液（ml）B》夜C液D》夜水0.10.120.10.120.10.120.10.120.10.1・20.10.120.1光密度（560nm）ODODODODODO酶液0.10.10.10.10.1*ODmax*仪器调零液中的“酶液"0.1ml,可以取对照植

5、株的，也可以取胁迫植株的。⑵将试管置于阳光下反应15分钟(NBT述原产物为蓝色)，然后在560nm下测定光密度(OD560)。(3)若样品反应后蓝色很浅或无，则须减少酶液用量后，再重复上表步骤；若样甜反应后蓝色极深或与无酶液同，则须增加酶液用量后，再重复上表步骤。4.2计算1个酶活单位SOD活性(u/g)=定义:SOD抑制N盯还原50%时的酶液用量(ml)。式中：U—1个酶活单位(ml)V-提取液总量(10ml)v-・测定酶液用量(0.1ml)W…植物材料鲜重或干重(g)5问题与讨论5.1在自然光照下，蓝

6、色几乎立即生成，至15分钟时基本稳定。但随照光时间延长，酶会失活，蓝色渐退。故照光时间以15分钟为好，不宜再长。5.2光质、光强、时间、温度、试管质地等因素均对结果产生影响，应尽量保持一致。5.3酶液用量应使处于合适范围之内，否则须加调整(见4.1(3))。5.4酶液在反应液中所占比重较小，对OD影响也小。但如果浑浊、有色，则需考虑其影响。实验2游离脯氨酸含量的测定(前三酮法)（操作步骤）1药品配制1.12.5%的酸性苗三酮试剂：称取2.5g前三酮一加入60ml冰醋酸一加入40ml6mol/L的磷酸一加热

7、溶解一冷却贮于棕瓶中备用。（85%的浓磷酸约为14.6mol/L）o1.23%磺基水杨酸：称取3g磺基水杨酸，溶于100ml蒸憾水中。2标准曲线绘制称取0.025g脯氨酸，定容于500ml蒸憾水中，配成浓度为50Mg/ml的脯氨酸母液。在沸水浴中加热显色50分钟一冷却至室温一测定OD5203游离脯氨酸测定3.1提取：称取0.5g植物材料一剪碎后放入试管中一加6ml3%磺基水杨酸一在沸水浴中提取10分钟一3000rpm离心5分钟。上清液为脯氨酸提取液。3.2测定：提取液1m

8、f冰醋酸1ml—苗三酮2m

9、f水

10、1ml—沸水浴中加热显色50分钟一冷却至室温一比色测定0D520（以蒸憾水为参比液）一查标准曲线得样品中Pro浓度。4计算脯氨酸含量（Pg/g）=式中：C…样品比色液的脯氨酸浓度（ug/ml）,由基于脯氨酸显色浓度的标准曲线查得。VI—样品研磨或煮沸提取液总量（本实验中6ml）V2—显色反应液（本实验中5ml）v—样品测定汲取液（本实验中1ml）W…植物材料重量（g）=C二C脯氨酸含量（Ug/g）=5问题讨论5.1若植物材料加