当归多糖联合阿糖胞苷诱导人白血病kg1α细胞株衰老实验探究

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1、当归多糖联合阿糖胞昔诱导人白血病KG1a细胞株衰老实验探究［摘要］作者实验室最新研究发现，当归多糖（Angelicasinensispolysaccharides,ASP）对延缓造血干细胞衰老有明确的调控作用。白血病是一种造血干细胞水平的恶性血液肿瘤，ASP对白血病细胞有无调控衰老的作用却未见相关报道。该研究以对数生长期人急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia,AML）细胞株KG1a为研究对象，将其分为当归多糖组（ASP组），阿糖胞昔组（Ara-C组）,当归多糖与阿糖胞昔联合组（ASP+Ara-C组）和对照组，分别

2、加入不同浓度的ASP,Ara-C和ASP+Ara-C，作用不同时间，旨在研究当归多糖联合阿糖胞昔诱导人白血病细胞株KGla衰老的作用及其相关机制。结果显示，ASP,Ara-C,ASP+Ara-C在体外能明显抑制KGla细胞增殖,使细胞阻滞于G0/G1期;细胞呈现衰老形态学特点；衰老染色阳性细胞率显著增高；并能显著上调衰老相关蛋白P16与RB的表达，ASP+Ara-C组的上述指标更加显著。综上所述，ASP与Ara-C诱导KG1a细胞衰老的机制可能与调控衰老相关蛋白的表达有关，提示ASP与抗肿瘤药物联合用药在白血病治疗中可起到更好作用。

3、［关键词］当归多糖；白血病；KGla细胞；衰老当归多糖（Angelicasinensispolysaccharides,ASP）是祖国医学“补血”要药当归的重要药效成分。本课题组既往工作和其他学者的工作证明，ASP对机体的免疫系统和造血系统有明显的促进作用，抗肿瘤和抗辐射损伤也显示良好的功效：1-4]o传统中医理论认为某些中药及其有效成分有“双向调控”作用，即对正常组织细胞和异常组织细胞的作用存在差异。本课题组最近研究发现，ASP对延缓造血干细胞衰老有明确的调控作用[5-6]o白血病是造血干细胞水平的恶性血液系统肿瘤，ASP是否对白

4、血病细胞有诱导衰老的作用是值得探讨的科学问题。本研究以人急性髓系白血病KGla细胞株为研究对象，研究ASP与Ara-C诱导人白血病细胞株衰老的作用及其相关机制，旨在为探讨天然药物有效成分调控肿瘤细胞衰老提供实验依据，为白血病等肿瘤的治疗提供新的思路和方法。1材料与方法1.1细胞株KGla细胞株由重庆医科大学临床检验医学院惠赠，在含10%胎牛血清的1640培养体系、37°C,5%C02的恒温培养箱中培养，每隔2〜3d换液传代1次。1.2药品、试剂与配制ASP购自陕西慈缘生物技术有限公司（批号CY130421,甘肃岷县当归提取，纯度29

5、5%）,1640培养液配制成所需浓度；Ara-C购自国药一心制药有限公司（国药准字H20055127,相对分子质量279.68）,1640培养液配制成所需浓度。RPMI-1640培养基（Hyclon公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；CCK-8（上海七海复泰生物科技有限公司）；Wright7s染液（本实验室配制）；衰老相关-B-半乳糖昔酶（SA-P-Gal）染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）；P16兔多克隆抗体（安博生物技术有限公司），3-actin鼠多克隆抗体、RB兔多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）

6、标记的山羊抗小鼠抗体、山羊抗兔抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。1.3细胞分组与增殖抑制率检测取对数生长期的KG1a细胞分为：ASP组，培养体系中加入0.5〜3g•L-1的ASP；Ara-C组，培养体系中加入0.05〜0.25g•L-1的Ara-C；ASP+Ara-C组，同时加入1〜2g・L-1的ASP和0.08〜0.16g・L-l的Ara-C；对照组，加入等量的培养液。调整细胞密度为5X107个/L,以每孔200UL的培养体系接种于96孔板，每个浓度分设3个复孔，同时设立无细胞的空白对照组。各组置37°C,含5%C02的孵箱中

7、培养24,48,72h,加入20uL的CCK-8继续培养4h,酶联免疫检测仪测定各孔A450,细胞增殖抑制率二（A对照组-A实验组）/（A对照组-A空白对照组）X100%o1.4流式细胞术分析细胞周期各时相分布分别收集培养48h的对照组（常规培养）、ASP组（终浓度2g-L-1）.Ara-C组（终浓度0.16g・LT）、ASP+Ara-C组（ASP2g・L-l+Ara-C0.16g・L-l)KG1ct细胞1X105个，PBS洗涤2次，用70%冷乙醇4工固定过夜。测定前将固定液遗弃,加入碘化丙噪和RNA酶工作液，在4°C染色处理30m

8、in,用300目滤网过滤后上流式细胞仪，经计算机数据处理，分析得出细胞周期的各时相比例。1.5SA-B-Gal染色分析细胞衰老收集细胞同1.4项方法，PBS洗涤2次，按试剂盒说明书操作。甘油封片镜检，将各组随机计数的400个细胞中的阳