人源抗菌肽ll-37真核表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

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1、人源抗菌肽LL-37真核表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达徐洪龙贡继尚高珊侯书宝张全伟胡俊杰马友记赵兴绪甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃农业大学动物医学院甘肃农业大学动物科学技术学院摘要：【目的】使人源抗菌肽I丄-37在真核表达载体中获得高效表达.【方法】采用RT-PCR技术，从人的血样屮扩増出1±・37基因片段，并将其连接至pcDNA3.1-His-V5(+)载体•通过脂质体介导法将重组质粒转入奶牛乳腺上皮细胞，G418筛选获得稳定阳性细胞株，并且利用RT-PCR和Western-blot检测目的基因在转录及翻译水平的表达情况.

2、【结果IRT-PCR结果显示，经转染的乳腺上皮细胞能够扩增出523bp的LL-37基因.qRT-PCR结果发现,LL-37mRNA在转染后的不同时期均有表达，经稳定转染的表达量最高•通过Western-blot检测，获得了约17kU的目的蛋口.【结论】结果表明，1±-37基因成功整合至奶牛乳腺上皮细胞并能够正确表达，这为构建分泌LL-37蛋白的奶牛乳腺生物反应器提供了依据.关键词：抗菌肽;LL-37;真核表达载体;车专染;qRT-PCR;Wcstc;作者简介：徐洪龙(1988-)，男，硕士研究生，主要从事发育生物学的研究.E-mail:xh

3、llyxhl@163.com作者简介：赵兴绪，男，教授，博士生导师，主要从事临床兽医学及发育生物学的研究.E-mai1:zhaoxx@gsau.edu.cn收稿日期：2016-04-13基金：甘肃省科技重大专项计划项目(1102NKDA022)ConstruetionandeukaryoticexpressionofhumanantimicrobialpeptideLL-37inbovinemammaryepithelialcellsXUHong-longGONGJi-shangGAOShanHOUShu-baoZHNAGQuan-weiH

4、UJun-jieMAYou-jiZHANGYongZHAOXing-xuCollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity;CollegeofVeterirmryMedicine,GansuAgriculturalUniversity;CollegeofAnimalScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity;Abstract：【0bjective]ToconstructpcDNA3.1-LL-37eukaryotic

5、expressionvectorandgetitshighexpression.[Method]TheLL-37geneamplifiedfromhumanbloodsamplebyRT-PCRwaslinkedtothepcDNA3.1vector.TherecombinantplasmiddefinedaspcDNA3.1-LL-37wasLeslifiedbysingleXhoIrestrictionenzymedigestion.Thentherecombinantplasmidwastransferredintothebovine

6、mammaryepithelialcellswithliposomeandwasscreenedbyG418.RT-PCRandWestern-blotwereappliedtochecktheexpressionsoftheplasmidattranscriptionandtranslationlevels.[ResuIt】The523bpofLL-37genewasobtainedfromthepost-transfectioncel1sbyRT-PCR.ThemRNAexpressionofLL-37genewasfoundindif

7、ferentperiodbyqRT-PCR,thehighestexpressionlevelwasfoundatstabletransfectionwhile17kUspecificbandwasobtainedbyWestern-blot.[Conclusion]ResultsshowedthattheLL-37genewassuccessful-lyinsertedintothechromosomeofbovinemammaryepithelialcells,whichprovidedthebasisfortheconstructio

8、nofLL-37proteinseerctiontocowmammaryglandbiorcactor.Keyword：nntimicrobinlpeptide;LL-37;eu