丹参smnac1基因克隆与生物信息学研究

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1、丹参SmNACl基因克隆与生物信息学研究［摘要］为了研究丹参中特有的NAC转录子在丹参生长发育、激素调节和抗逆胁迫应答调节中的功能，对丹参NAC转录因子进行了克隆和分析。根据丹参毛状根cDNA文库中筛选到的NACEST序列，克隆了丹参SmNAC1的cDNA全长序列。生物信息学分析显示基因的开放阅读框591bp,编码166个氨基酸，相对分子质量21.66kDa,等电点4.36GenbankkF006346。SmNACl蛋白的N-端具有保守的NAC_AB结构域，C-端高度变异。根据软件预测SmNACl可能定位在细胞核。qRT-PCR分析YE+Ag+处理后SmNACl在丹参毛状根中的表达

2、变化，处理后2h表达量上调至对照的1.5倍，4〜12h保持2倍的表达量，36h时下降至对照水平以下，推测SmNACl可能参与了丹参毛状根对YE+Ag+的胁迫应答调节。［关键词］丹参；NAC转录因子；SmBF3-2；分子克隆；生物信息学NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族，在植物的生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，目前为止已经从拟南芥中鉴定出117个NAC转录因子基因［1-2］,水稻中151个［3］,葡萄中143个［4］,毛果杨中163个［5］,烟草［6］和大豆［7］中各有152个。NAC家族转录因子N-端有一个高度保守的NAC结构域，可进一步分为A-E5个保守

3、的子域，具有DNA结合(DNABinding)或蛋白质和二聚体结合功能。与N-端的保守不同，NAC的C端无论是在氨基酸序列还是长度方面都具有髙度的多样性，具有转录激活、抑制或者与蛋白质结合活性[8]。实验证明不同物种的高同源性NAC基因可能执行不同的功能。NAC基因参与介导胁迫对植物生长发育的影响，这往往是生物胁迫间、非生物胁迫间以及生物与非生物胁迫间信号调控通路的关键节点[9]。目前关于NAC的研究较少，且多集中于拟南芥、水稻等模式植物。在丹参中仅克隆到1条NAC转录因子SmBTF[10]。本研究组从丹参毛状根cDNA文库中得到1条NAC转录因子的EST序列，在此基础上克隆得到了

4、SmNACl基因的全长cDNA序列，并通过生物信息学分析其编码的蛋白质理化性质、保守功能域等生物学信息，为进一步研究丹参中该类转录因子提供信息和依据。1材料用丹参叶片经农杆菌ACCC10060介导产生的不定根[11-12],用6,7-V培养基继代，恒温26°C,80r・min-1摇床暗培养培养18d,用终浓度30mmol・L-lAg+和100g・L-1酵母提取物联合处理，0,2,4,8,12,24h取样,液氮速冻，-80°C保存。2方法2.1RNA提取与反转录采用Trizol法提取丹参毛状根总RNAo取0・1g毛状根，加入0.2mg聚乙烯聚毗咯烷酮(polyvinylpyrroli

5、done,PVPP),在液氮中研磨粉碎，加入1mLTrizol(Ambion公司)室温放置10min充分裂解,4°C12000r-min-1离心取上清，依次用氯仿和异丙醇洗脱，75%乙醇-20°C沉淀2h,最后用20uL去除RNA酶的水溶解。用NANODrop核酸定量仪测定RNA浓度，取1.0ugRNA,应用Thermo反转录试剂盒，按照附带的操作流程利用Oligo(dT)18引物反转录成总cDNAo2.2SmNAClcDNA全长克隆根据得到的SmNACl基因片段设计PCR特异性引物SmNACl-F:5'-ATGACTCAATCCCAGGAGGAG-3',SmNAC1-R:5’-C

6、TAGTTTGTGAGCTCCATAATGG-3z,以丹参毛状根总cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为ddH2O15.4uL,dNTP1.6uL,ExTaqBuffer2.0PL,引物(10nmol•LT)各0.4HL,ExTaq(5U•L-l)0.1uLo扩增条件为95°C5min；95°C30s,55°C30s,72°C1min,30个循环，72°C延伸10mine1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用ThermoGeneJETPCR纯化试剂盒纯化PCR产物后连接pGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a,挑取阳性单克隆送北京华大基因研究中心测序。2.3Sm

7、NACl生物信息学分析将全长cDNA序列在NCBI数据库的ORFFinder(http://ww.nebi.nlm.ni.gov/gorf/orfig.cgi)中分析SmNACl序列的ORF,推导编码氨基酸的基因序列。应用BLAST程序(http://www.enbi.nlm.nih.gov)检索相似蛋白，用ClustalW(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)对氨基酸序列进行多重比对，并用MEGA4NJ法(