南方红豆杉水提物抑制裸鼠a549肺癌移植瘤生长和其机制探究

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1、南方红豆杉水提物抑制裸鼠A549肺癌移植瘤生长和其机制探究［摘要］目的：研究南方红豆杉水提物对裸鼠A549肺癌移植瘤生长的抑制作用和机制。方法：建立荷A549肺癌移植瘤模型，随机分为对照组、低、中、高剂量南方红豆杉水提物实验组，24h后以等体积生理盐水及药物灌胃，给药7周，每3d测移植瘤长短径，绘制移植瘤生长曲线，给药7周后处死裸鼠，取瘤组织，计算抑瘤率，采用Real-timePCR及Westernblot方法检测mRNA和蛋白水平。结果：南方红豆杉水提物各剂量组均有明显抑瘤效果（P2.4Real-tim

2、ePCR检测mRNA水平取50〜100mg移植瘤组织，Trizol法提取总RNA,Nanodrop2000分光光度计测定RNA浓度，确定RNA的纯度及浓度，A260/A280在1.8〜2.0。按试剂盒说明进行PCR逆转录后，荧光定量PCR仪进行扩增。以管家基因GAPDH为内参基因，设计引物如下：Survivin上游引物5’-CTACCGAGAACGAGCCTGATT-37,下游引物5’-AGCCTTCCAATTCCTTAAAGCAG-37,扩增产物长度60bp；VEGF上游引物5’-TTTGGCAAATA

3、CAACCCTTCAGA-3z，下游引物5’-GCAGAAGATACTGTCACCACC-37，扩增产物长度133bp；EGFR±游引物5’-ATGAAAACACCTATGCCTTAGCC-3'，下游引物5’-TAAGTTCCGCATGGGCAGTTC-3',扩增产物长度83bp；GAPDH上游引物5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-37,下游引物5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3;,扩增产物长度123bpo反应条件：95°C3min,1个循环进行预变性，95°C5s,

4、60°C1min,循环40次。熔解曲线分析：95°C15s,20°C•si；60°C15s,20°C•si；95°C15s,0.1°C•slo荧光定量结果采用2-AACt方法分析，统计相对表达量RQ(relativequantifiedtion)值。2.5Westernblot检测蛋白表达取液氮保存的肿瘤组织，生理盐水冲洗，切取重约20mg小块，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白酶抑制剂的裂解液，碎冰上高速机械匀浆器12000r・mini破碎组织，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，等量上样，10%SDS-PA

5、GE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h,一抗(1:1000)4°C摇床孵育过夜，TBST洗膜10minX3次，二抗(1:3000)室温摇床孵育1h,TBST洗膜10minX3次，ECL显色后化学发光成像系统成像。以Quatityone图像分析软件进行积分吸光度值分析。2.6统计学方法用SPSS17.0统计软件进行分析处理。计量资料数据用土s表示，各组间差别选用单因素方差分析,P本实验研究结果表明，南方红豆杉水提物干预荷肺癌A549移植瘤裸鼠后，对比对照组，各实验组移植瘤组织中VEGFmRNA表

6、达无明显影响，VEGF蛋白表达有下降趋势，但无统计学意义，提示南方红豆杉水提物可能对肺癌A549移植瘤的血管生成无明显影响。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoptosis,IAP)的新成员，是目前发现最强的凋亡抑制因子，其功能复杂，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转化并参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用［8-9］oSurvivin具有肿瘤特异性，几乎表达于所有的恶性肿瘤，但在人体正常终末分化的组织细胞中不表达或低表达，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关

7、。肺癌患者血清中，同样可以检测出Survivin抗体。Survivin因其独特的生物学特性有望成为肺癌治疗的新靶点。本实验研究表明，南方红豆杉水提物干预荷肺癌A549移植瘤裸鼠后，对比对照组，各实验组移植瘤组织中SurvivinmRNA及蛋白表达水平均明显下降，且具有统计学意义，这与体外实验结果一致［10］,提示抑制Survivin表达有可能是南方红豆杉水提物体内抗肿瘤机制之一。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一种相对分子质量为170KD的跨膜糖蛋

8、白，配体通过与EGFR相互作用，激活下游RAS/MAPK系统、PI3K/AKT系统、PLC/PKC系统，从而将有丝分裂信号向下传递，调控细胞周期，调节细胞增生、存活、黏附，促进损伤修复［11］。此外，EGFR信号通路激活后可促进细胞的增殖、转移、浸润、血管生成以及阻断细胞调亡。恶性组织中EGFR的表达水平高于正常组织，在40%〜80%非小细胞肺癌患者中EGFR呈过度表达。因此，阻断或者削弱EGFR信号通路是治疗非小细胞肺癌的一