microrna-126抗肺癌a549裸鼠移植瘤生长的实验研究

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1、MicroRNA-126抗肺癌A549裸鼠移植瘤生长的实验研宄李勋光1万珙善1（通讯作者）梁艳霞1苏长青2董洪芳1（1江苏省赣榆县人民医院呼吸科江苏赣榆222100）（2上海第二军医大学东方肝胆医院检验科上海201802）【摘要】目的：研究miR-126对肺癌A549裸鼠移植瘤生长的作用，探索miR-126作为肺癌基因治疗靶点的可能性。方法：培养肺癌细胞系A549,接种至裸鼠皮下。成瘤后釆用表达miR-126的腺病毒进行干预治疗，观察瘤体生长情况；观察期结束，取瘤体做miR-126靶基因Sox2表达的免疫组化检测。结果：以总量l×109pfu的重组腺病毒Ad5-miR

2、126直接瘤内多点注射,A549移植瘤的生长速度明显被抑制；与对照组相比差异有显著性（P<0.001）;治疗后，瘤体组织内miR-126表达明显升高，同时伴随Sox2表达的降低。结论：miR-126在肺癌的发生发展中其重要作用，其作为肺癌治疗的靶点，能够明显抑制肺癌A549裸鼠移植瘤的生长，其作用机制之一使降低其靶基因Sox2的表达。【关键词】肺癌；microRNA-126；移植瘤；Sox2【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）31-0153-03越来越多的研究证明，MicroRNAs（miRNAs）能够调控基因的表达，从而参与细胞

3、生长、细胞凋亡、组织生长、组织形态形成和肿瘤发生发展等生理病理过程［1,2］。近来，miR-126在肺癌中的作用受到我们的关注［3-5］。我们的前期研究表明，肺癌细胞A549表达miR-126的水平明显低于肺成纤维细胞IMR-90细胞，转染miR-126表达载体后提高miR-126表达后，A549细胞存活率明显降低，细胞周期G0/G1期细胞比例上升而S期下降，提示miR-126能够抑制肺癌细胞增殖活性，诱导细胞周期阻滞；临床肺癌标木的检测，也证实肺癌组织miR-126表达水平明显低于癌旁肺组织，而且miR-126高表达的肺癌患者无瘤生存期（DFS）和总生存期（OS）均明显高于低表

4、达患者［6］。我们判断，miR-126在肺癌的发生发展中起重要作用，有可能成为肺癌治疗的可选靶点之一。因此，我们设计miR-126表达载体治疗A549裸鼠移植瘤的实验，观察其对肿瘤生长的抑制作用。1.材料与方法1.1细胞与材料人肺癌细胞A549购自中国科学院上海细胞研究所细胞库，在含10%胎牛血清的DMEM培养液、3代、5%CO2条件下培养。携带绿色荧光报告基因（EGFP）的miR-126表达载体pGenesil-miR126（阴性对比pGenesil-miNC）由第二军医大学东方肝胆外科医院及国家肝癌科学中心分子肿瘤实验室构建并保存。胎牛血清、DMEM培养基、TriZol试剂为

5、Gibco公司产品，鼠抗人Sox2抗体及免疫组化试剂盒购自美国SantaCruz公司，实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）试剂及miR-126引物由大连宝生物（TAKARA）公司提供。1.2腺病毒构建及重组将pGenesil-miR126表达载体的miR-126表达框完整地酶切下来，插入到5型腺病毒（Ad5）的El缺失区，构建miR-126腺病毒Ad5-miR126。以对照载体pGenesil-miNC的相应酶切片段代替miR-126表达序列，构建对照腺病毒载体Ad5-miNC。Ad5-miR126和Ad5-miNC在293细胞中扩增，纯化后备用。1.3裸鼠移植瘤实验健康纯

6、种BALB/C裸鼠30只，4周龄，雄性，中科院上海斯莱克实验动物中心提供。取对数生长期A549细胞悬液注射于裸鼠右腋皮下，5×106细胞数/100µl/只。接种后10天，成瘤率100%，移植瘤直径大约0.5cm左右。随机分为3组（Ad5-miR126、Ad5-miNC、空白对照组）。Ad5-miR126和Ad5-miNC组分别给予相应腺病毒瘤内多点注射，每次每只剂量2×108pfu/100µl,隔天一次，共5次。空白对照组小鼠同步注射生理盐水，每次每只100µl。治疗后，每周测量瘤体大小，以“最大径×最小径2

7、×0.5”公式计算瘤体体积。观察周期结束，麻醉处死小鼠，取瘤体标本，一部分新鲜组织提取总RNA,用于miR-126表达水平的qRT-PCR检测。•其余组织以10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋切片，备用于miR-126靶基因Sox2表达的检测。1.4miR-126表达水平的qRT-PCR检测瘤体标本按TriZol试剂提取细胞总RNA,以miR-126逆转录引物(5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACC