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1、FasFasL蛋白在不同浓度葡萄糖小鼠囊胚中的表达及意义张丽萍1耿新华2张端莲*（1•湖北医药学院附属太和医院妇产科
2、•垠4420002湖北十垠张湾区花果医院妇产科十垠442000;*武汉大学医学部基础医学院湖北武汉430071）【摘要】目的：探讨Fas/FasL蛋白在不同浓度葡萄糖小鼠囊胚中的表达及意义。方法：通过促超排卵，获取妊娠3.5d小鼠囊胚，随机分成三组，即对照组（空白）、低糖组（葡萄糖浓度为7.5mmol/L和高糖组（葡萄糖浓度为28.0mmol/L）,分别培养在含0、7.5mmol/L和28.0mmol/L葡萄糖的M199
3、培养基中，培养24h后，然后再吸出囊胚。每组随机吸取30个囊胚用免疫组织化学S・P法，检测不同浓度葡萄糖对小鼠囊胚Fas/FasL蛋白表达状况，利用HPIAS-1000图像分析系统测定Fas/FasL蛋白在以上三组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果:Fas/FasL蛋白表达结果：空白组中囊胚细胞胞浆中可见少量浅棕黄色颗粒，Fas/FasL蛋白表达呈弱阳性。低糖组中囊胚细胞胞浆未见着色，Fas/FasL蛋白表达呈阴性。高糖组囊胚细胞胞浆中可见较多的棕黄色颗粒，Fas/FasL蛋白表达呈强阳性。空白组与低糖组囊胚Fas/FasL蛋白表
4、达的阳性面积率及平均光密度无显著性差异（P>0.05）,高糖组与空白组和低糖组相比均存在显著性差异（P<0.01）o结论：Fas/FasL蛋白通过执行细胞凋亡的功能，在髙浓度葡萄糖中过度表达，导致囊胚细胞数目过度减少，从而影响囊胚的正常发育和着床。【关键词】葡萄糖；Fas/FasL蛋白；囊胚；小鼠；免疫组织化学【中图分类号】R587.1【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）10-0325-02Fas/FasL蛋白作为可直接启动细胞凋亡的信号途径，是介导细胞凋亡最为重要的膜蛋白分子。Fas/FasL蛋白作为
5、介导细胞凋亡的重要膜蛋白分子，在正常免疫反应、造血调控、机体细胞数量的恒定与调控、无功能或异常细胞的清除等牛理功能以及多种遗传性、获得性疾病的病理机制中具有十分重要的意义。木实验验以小鼠囊胚为观察对象，通过体外培养小鼠囊胚，并对囊胚细胞采用免疫组化方法和图像分析技术，观察Fas/FasL蛋白在不同浓度葡萄糖小鼠囊胚中的表达,从而探讨高浓度葡萄糖对小鼠囊胚凋亡的影响，为糖尿病妊娠导致胎儿畸形的机制和预防提供参考依据。1材料和方法实验动物和试剂:一级健康昆明种小白鼠（SPF级，由武汉大学医学院动物实验中心提供）。孕马血清（PMSG,天津生物
6、制品厂）；人绒毛膜促性腺激素（HCG,天津生物厂）；D・葡萄糖（武汉凌飞生物技术公司）；M199培养基（美国Sigma生物技术公司产品）；浓缩型兔抗人Fas多克隆抗体即用型S-P免疫组织化学试剂盒（北京中杉生物技术公司提供）。1.2小鼠囊胚的获取:小A鼠,雌雄各40只”鼠龄8-10wk,体重（30±5）克,光照、黑暗各12h,自由摄食、饮水。于雌鼠腹腔注射10UPMSG,48h后再腹腔注射10UHCG促超排卵，当晚与雄鼠1:1合笼。次日晨检查阴栓，见阴栓者记妊娠0天。于妊娠3.5d吋，将孕鼠脱臼处死，放入75%酒精中浸泡消
7、毒约5min,于超净工作台上取出子宫，由阴道端插入7号针头注入M199培养基，冲出囊胚，一侧子宫可获取约10-20个。将所有的囊胚冲入凹皿中，并用PBS洗涤囊胚5min×3次。然后随机的用作不同实验。所有操作均在解剖显微镜下进行。1.3胚胎培养:将所有囊胚随机的分为3组，即对照组（空白）、低糖组（葡萄糖浓度为7.5mmol/L）和高糖组（葡萄糖浓度为28.0mmol/L）o将囊胚培养在35mmFalcon塑料培养皿中，每皿加入lmlM199培养基，含有30个囊胚，低糖组中加入7.5mmol/L的D■葡萄糖，高糖组中加入28.
8、0mmol/L的D■葡萄糖，对照组不加葡萄糖。每组培养基均加入0.3%BSA,1mmol/L谷氨酰胺，并置入37°C,5%C02培养箱内培养24h。1.4免疫组织化学S-P法检测Fas/FasL蛋白的表达:小鼠囊胚培养24h后，用毛细管吸出囊胚，PBS冲洗囊胚5min×3次;4%多聚甲醛固定10min,PBS洗涤5min×3次，将囊胚转到涂有多聚赖氨酸的玻片上，干燥24h；将载有囊胚的玻片用蒸镭水洗涤5min×3次；1%trironX-100作用10min,增加抗体的穿透性，蒸憾水洗涤5min&tim
9、es;3次；3%过氧化氢，37€孵育10口泊以抑制内源性过氧化物酶活性，蒸镭水和PBS各洗4×5min；正常羊血清37°C孵育35min以减少非特异性反应，甩干;一抗（Fas,l:200）37°
