脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮保护作用的研究

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1、脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮保护作用的研究［摘要］目的观察脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮的保护作用。方法雄性SD人鼠随机分为假手术组、脑损伤组和黄体酮治疗组，大鼠脑损伤模型制作是利用改良的Feeney口山落体损伤装置。各组于伤后24、48、72h取材。用免疫组织化学法观察大鼠皮质和海马CA1区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达水平变化。结果脑损伤组的Caspase-3阳性细胞数在皮质和海马CA1区较假手术组显著增加，黄体酮治疗组与脑损伤组比较，Caspase-3阳性细胞数明显减少，差界有统计学意义(P〈0.05)。结论黄体酮抑制脑损伤后Caspas

2、e-3的表达可能是黄体酮脑保护作用机制之一。［关键词］黄体酮；脑损伤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3［中图分类号］651.1+5［文献标识码］A［文章编号］1674-4721(2014)11(a)-0012-03脑损伤是严重危害人类健康和威胁生命的疾病之一。脑损伤后的继发性损伤以往认为主要是神经细胞水肿和坏死，近年发现创伤性脑损伤后存在10%〜50%的细胞凋亡，而且主要存在于皮质和海马等部位。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)处于细胞凋亡过程中的关键地位，是细胞凋亡过程的最终执行者［1］,在脑损伤后各种病理因素作用下，Caspase-3被激活，通过作用于底物引起细

3、胞凋亡。对脑损伤后的继发性损伤，目前尚无有效的治疗药物。近年研究发现，黄体酮(progesterone,PROG)作为一种神经當体激素，在体内、体外等多种实验中已经证实具有脑损伤保护作用[2],但PROG对脑损伤后细胞凋亡的影响存在争议。本实验通过建立Feeney自由落体大鼠脑损伤模型，利用免疫组织化学技术，探讨PROG对大鼠脑损伤后Caspase-3表达的影响，以阐明PROG对脑损伤的保护作用。1材料与方法1.1实验材料及仪器恒冷箱组织切片机，CM1900型，德国Leica公司；Olympus显微摄影装置,PM-10AD型，日本Olympus公司。PROG试剂，购自Sig

4、ma公司；Caspase-3—抗试剂，购自武汉博士德公司。1.2实验分组雄性成年SD大鼠54只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重250-300go实验动物随机分为3组：假手术组18只、脑损伤组18只、PROG治疗组18只；每组乂分为24、48、72h3个时间点检测细胞凋亡的变化。1.3动物模型采用改进的Feeney自由落体方法建立大鼠创伤性脑损伤模型。麻醉采用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后切开头皮，打开直径5mm的骨窗，其位置在矢状缝后1.5mm,中线旁2.5mm处；自由落体重锤质量40g,从25cm处高度自由落下造成脑损伤。假手术组仅切开头皮，在相同位置开同样大

5、小的骨窗。PROG试剂溶解于22.5%2-轻丙基-0-环糊精溶质中，PROG治疗组伤后1、6h腹腔注射PROG16mg/kg以利于快速吸收，接下來连续每天1次皮下注射。1.4免疫组织化学检测分别于伤后24、48、72h3个时间点，对大鼠脑组织进行甲醛灌注,并且取材固定，自视交叉后做片厚5uni的冠状切片待用。Caspase-3免疫组织化学检测采用SP法，按照免疫组织化学法说明书加入一抗和二抗等操作。切片在400倍光镜下观察，利用免疫组织化学CMIAS真彩色医学图像自动分析系统进行阳性细胞计数，以5个视野的平均值代表各区计数结果。1.5统计学处理数据采用SPSS16.0软件进

6、行统计分析，计量资料用均数土标准差（x±s）表示，采用方差分析，以卩〈0.05为差异有统计学意义。2结果假手术组少见Caspase-3表达，脑损伤组伤灶周围皮质和海马CA1区,可见大量Caspase-3阳性细胞表达；与假手术组比较，脑损伤组的Caspase-3阳性细胞表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；黄体酮治疗组在损伤的周围皮质和伤侧海马CA1区Caspase-3表达与脑损伤组比较明显减少，差异有统计学意义（P〈0・05）（表1）。3讨论随着社会的发展，脑损伤患者逐年增多。发达国家的颅脑损伤年发生率高达（150〜250）/10万人；我国颅脑损伤的年发生率为（1

7、00〜200）/10万人，直接和间接经济损失高达数百亿元。脑损伤可以分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤无法恢复；而继发性损伤通过钙超载、兴奋性神经递质的释放、脂质过氧化反应、自由基产生、炎症反应等多种因索加重脑损伤，进而影响神经功能［3-4］o英中细胞凋亡在继发性脑损伤中扮演重要角色［5-6］,Caspase是细胞凋亡事件的执行者，Caspase-3的激活通过作用于DNA修复蛋白、细胞骨架蛋白等裂解，最终发生细胞凋亡。PROG对脑损伤后细胞凋亡的影响存在争议。Djebaili等［7］通过建立脑损伤模型，给予PR