研究bmp-2对骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响

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1、四川医科大学硕士学位论文研究BMP-2对骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响李书坛朱小凤黄纯兰通讯作者：黄纯兰教授，联系方式：电话18090859929邮箱huangcll880@163.com国家自然基金课题81450030资助李晓明[摘要]目的：通过非接触共培养HSC与MSC，并用rhBMP-2干预，在第三天时检测HSC的增殖，可以探讨MSC和BMP-2对HSC增殖的影响以及BMP-2如何调节MSC对HSC增殖。方法：利用Transwell（小室微网孔径0.4um)非接触共培养经磁珠分选的骨髓HSC与全骨髓

2、法体外扩增至P3代的MSCs，并用BMP-2干预。培养至72小时用计数板计数每组HSC的四个复孔的数目、TRIZOL法提取各组HSC的RNA后测定各组HSC的RNA的含量以及qRT-PCR法检测各组HSC的增殖基因Ki67的mRNA的表达。结果：1.全骨髓法成功培养出MSCs；磁珠分选法分选出了较高纯度的HSC。2.三天后各组HSC增殖的情况：①细胞计数（×104个）：HSC+MSC组(3.03±0.50）、HSC+BMP2组(1.70±0.51)均高于HSC组（1.2±0.43）；HSC+MSC+BMP2组(5.

3、29±0.20)高于HSC+MSC组(3.03±0.50）。②RNA量:HSC+BMP2组（138±3.464）及HSC+MSC组（163±3.559）高于HSC组(113±2.944)；HSC+MSC+BMP2组（241±3.651）高于HSC+MSC组（163±3.559）。③荧光定量PCR法检测HSC的Ki67的mRNA相对表达量：HSC+MSC组(3.27±0.08）及HSC+BMP2组(2.44±0.26)高于HSC组（1.00±0.13）；HSC+MSC+BMP2组(5.08±0.20)高于HSC+MS

4、C(3.27±0.08)；以上P值均＜0.05。结论：BMP-2可以促进HSC增殖；MSC可以促进HSC增殖；BMP-2可以促进MSC对HSC的增殖作用。关键词：造血干细胞；间充质干细胞；BMP-2；微龛；增殖；四川医科大学硕士学位论文生存在骨髓微环境即微龛（niche）中的造血干细胞（HSCs）为所有成熟血细胞的原始造血细胞，由于在骨髓中CD34抗原主要存在于幼稚造血干/祖细胞(HS/PC)、极少量骨髓基质细胞和内皮细胞的表面，故CD34抗原是造血干/祖细胞的重要标志，我们常用此抗原分选HSC。间充质干细胞（MS

5、C)是微龛中的重要干细胞，体外培养具有贴壁性；表达CDl05、CD73、CD90等一些特定的表面抗原，不表达CD45、CD34、等造血标记；可以向成骨细胞、内皮细胞等各种细胞分化。微龛极其复杂，由基质细胞及其前体间充质干细胞（MSCs）、细胞因子、细胞外基质等组成。niche主要分为“成骨微龛”和“血管微龛”，前者主要维持HSC静息状态，后者可以调节HSC增殖、分化、迁移等。目前关于MSC对HSC增殖影响的研究较多。骨形态发生蛋白（BMP)-2在造血调控中也起重要作用。此外BMP-2作为重要的成骨因子可刺激MSC分

6、化为成骨细胞，构成“成骨niche”的主体结构，BMP-2还能促进血管的形成，关于它在成骨niche中的研究较多，而其在血管niche方面的作用研究较少。目前关于MSC促进HSC增殖的研究较多，而关于BMP-2对MSC促进HSC增殖的影响的研究较少。四川医科大学硕士学位论文1材料与方法1.1骨髓来源骨髓取自健康志愿者。骨髓采集经伦理委员会批准授权，抽取适量骨髓至肝素钠离子抗凝管，充分混匀，均在半小时内使用。1.2主要实验试剂及其配制、分装和保存LG-DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、0.25%胰蛋白酶，美国

7、Gibco公司；ECD标记的小鼠抗人CD34、FITC标记的小鼠抗人CDl05、PEcy7标记的小鼠抗人CD45、鼠抗人IgG抗体，美国Pharmingen公司；人CD34+细胞选择试剂盒、miniMACS磁珠分选分离装置、中号分离柱子，MitenyiBiotec公司；重组人干细胞因子（无菌PBS稀释成浓度为200ng/ml，混匀后分装，-20℃保存）、重组人白介素-3（PBS稀释成浓度为500ng/ml，混匀后分装，-20℃保存）、重组人骨形态发生蛋白-2（PBS稀释成浓度为1ug/ml，混匀后分装，-20℃保存

8、），RD公司；引物，上海生工生物工程股份有限公司；反转录试剂盒子，日本TOYOBO公司；PCR试剂盒，德国QIAGEN公司；TRIZOL试剂盒，美国Invitrogen公司；24孔transwell小室，美国Costar公司。其中MSC培养基：低糖DMEM89%+胎牛血清10%+青链霉素1%，4℃保存。HSC的培养基：10%FBS、SCF50ng/ml、IL