细胞atpadpamp含量高效液相色谱法（hplc）定量检测

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1、细胞ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP或AMP波峰，以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物或人体细胞裂解样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景腺嘌呤核苷酸（adeninenucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二

2、磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosinemonophosphate；AMP），又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylicacid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子

3、式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylatekinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosinediphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处

4、理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。产品内容清理液（ReagentA）60毫升裂解液（ReagentB）10毫升酸性液（ReagentC）1毫升中和液（ReagentD）2毫升流相液A（ReagentE）500毫升流相液B（ReagentF）500毫升标准液（ReagentG）500微升产品说明书1份保存方式5保存标准液（ReagentG）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（ReagentC）和中和液（ReagentD）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备HANK平

5、衡盐缓冲溶液（GMS12028）或PBS缓冲溶液（GMS12033）：用于清理细胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞处理所需的培养基15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作的容器4℃（微型）台式离心机：用于样品操作DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞高效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定实验步骤一、样品准备1．准备1瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（1X107），直至细胞生长铺满整个培养表面2．加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细

6、胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去3．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面4．置入37℃培养箱3分种5．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，6．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液7．移入一个50毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从此步骤开始）8．放进台式离心机离心10分钟，速度为200g9．小心抽去上清液10．加入3毫升预冷的清理液（ReagentA），混匀细胞11．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g12．小心抽去上清液13．加入500微升预冷的裂解液（ReagentB）14．涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群15．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器16．

7、在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下）17．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管18．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g19．小心移取360微升上清液到1.5毫升离心管1．加入40微升预冷的酸性液（ReagentC）2．涡旋震荡1分钟3．转移到1.5毫升离心管4．放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g51．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管2．加入62微升中和液（ReagentD），充