超声波破碎-高效液相色谱法定量检测核酸.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第9蝴2011年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1442～l446超声波破碎一高效液相色谱法定量检测核酸董莲华盛灵慧王晶黎朋(巾国计量科学研究院，北京100013)摘要采用超声波破碎结合高效液相色谱技术，建立1r定量检测质粒DNA的方法，测垃结果可以溯源至核酸标准物质。采用超声波破碎(功率300W，频率24kHz)技术将质粒DNA破碎成200500bp的小片段DNA，冉用蛇毒磷酸二酯酶将其水解为4种核苷酸(dCMP：3．2min；dTMP：4．7rain；dGMP：5．3

2、rain，dAMP：6．8min)，将产物通过HPLC分离后，采用外标法进行定量分析。应用此方法对待测质粒pNK603进行定分析，测定的4种核苷酸的摩尔百分比(A：T0．95C：G一0．98)与理论值接近。木方法的测定结果(47．24~tg／g)与实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR，45．98gg／g)和PicoGreen荧光染料法(46．02gg／g)的测定结果没有酱差异，表明建赢的超声波HPLC方法可以应用于质粒DNA的定量分析。关键词质粒；超声波破碎；高效液相色谱；荧光；聚合酶链式反应l引言核酸是生物遗传信息的载体，对核酸的定量分析是解析核酸结构和功能的基

3、础。日前定量分忻十幺酸的方法根据其原理的不同分为两类：一类是直接定量检测核酸，主要是通过应用标探针的杂交反应进行定量检测；另一类是将待测核酸扩增后，再通过酶免疫法(EIA)、发光分析、荧光分析等方法定量枪测扩增产物，主要是定量聚合酶链式反应(PCR)技术。在应用上述方法测定核酸含量时，其测量结果的溯源性、可比性还未引起关注。但是，住核酸标准物质制备过程中(如质粒分子标准物质)，其核酸测量溯源的重要性就凸显出来。为了解决核酸定量测量的准确、溯源问题，各国都在进行探索。本研究试图通过色谱或质谱技术建立一个可溯源的高准确度的测量方法，即将双链的基组或质粒核酸水解成单核

4、苷酸，通过同位素稀释质曙法测定水解后的核苷酸的含量，据此计算核酸的浓度；还可根据核酸序列信息及4种核苷酸的摩尔浓度检查核酸水解是否完全。应用这种方法测定的结果可以溯源到核苷酸标准品，从而解决核酸测量的溯源问题。日前，应用同位素稀释质谱测定寡核苷酸(20mer)浓度的方法已经比较成熟⋯，但是对于双链，且K度大于几百个碱基对的核酸片段的定量分析，除了紫外吸收法、定量PCR和荧光染料法外，于缺乏相应的标准品，还没有其它成功的方法可用。长片段核酸无法直接完全酶解，[大I此，建立一个可以将长片段核酸碎裂为小片段核酸进而_1『以完全水解的方法，是实现大片段核酸的色谱、质谱及

5、毛细管电泳定量分析的关键。本实验的目的是以质粒DNA为分析对象，利用超声波破碎技术将其破碎成小片段DNA，通过优化条件使其破碎后的产物_口『以进行完全酶解，酶解产物利用高效液相色谱(HPLC)进行定量分析，以期建立一个溯源链清晰，准确度高的核酸定量测量方法。2实验部分2．1仪器与试剂1200液相色谱仪(安捷伦中同有限公司)；酶标仪(M200，TECAN)、荧光定量PCR仪(AB7900HT，荚同ABI公司)；JY92ⅡD超声波破碎仪(南京新辰公司)。TaqmanUniversalMasterMix试剂盒(4304437，美国ABI公司)；SB-AQ色谱柱(150

6、mmX4．6mm，安捷伦中国有限公司)；特异性引物和探针(上海英俊公司合成)，其中探针5端采用荧光标记基团FAM进行标记，3端采用荧光猝灭基团TAMRA进行标。201卜0104收稿；201104—15接受本史系科技支撑项目(N02008BAK41B01)和博士科研专项基金(NoATQDB0908)资助Email：lianhuadong@gmail．corn第9期董莲华等：超声波破碎一高效液相色谱法定量检测核酸具体序列见表1。乙腈(色谱纯)、蛇毒磷酸二酯酶(SVP)、4种核苷酸标准品，均购自美国Sigma公司。表1NK603特异性序列和内源基因扩增引物和探针Tab

7、le1PrimersandprobesforGM(geneticmodified)maizeNK603eventspecificgeneandendogenousgene2．2实验方法2．2．1超声波处理及酶解取2mL质粒pNK603DNA进行超声处理，重复7次。处理条件：功率300W，频率24kHz，超声4s，间歇4S。T作时间50min。取超声波处理后的DNA样品60uL，加入8gLSVP(5mg／L)和8pLSVP缓冲液，37℃酶解3h，85℃酶解20min。设置3个平行，分别以不加SVP和不加DNA样品为酶解样品的对照。同时将未经超声波处理的质粒DNA直

8、接进行酶解作为超声波处理