rps14基因重组慢病毒载体的构建及其在mutz-8细胞中的表达

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1、RPS14基因重组慢病毒载体的构建及其在MUTZ-8细胞中的表达罗静，蒋文，刘林，王利（400016重庆，重庆医科大学附属第一医院血液科）[摘要]目的构建携带人RPS14基因重组慢病毒载体获得稳定产毒的细胞，并观察其在人MDS细胞株MUTZ-8细胞中的表达。方法通过逆转录方法，获得目的基因RPS14；将目的基因克隆入慢病毒表达质粒pGC-FUVector，构建含有RPS14基因的重组慢病毒载体pGC-FURPS14，经PCR、酶切及测序鉴定其正确性；在Lipofectamine2000介导下，将成功构建的质粒pGC-FURPS14与慢病毒包装质粒pHelper1.0、p

2、Helper2.0共转染293T细胞，通过实时定量PCR法测定病毒滴度，并将获得的重组慢病毒载体pGC-FURPS14转染人MDS细胞株MUTZ-8，用流式细胞仪检测转染效率，RT-PCR检测靶细胞内RPS14mRNA的表达。结果含有RPS14基因的重组慢病毒载体经PCR、酶切和测序鉴定构建正确,且测定的病毒滴度为2.0×109TU/ml。流式细胞仪检测其转染效率为68.41%，RT-PCR检测到转染后RPS14mRNA在靶细胞中的稳定表达。结论构建了携带人RPS14基因的慢病毒载体，转染人MUTZ-8细胞株后能够稳定表达RPS14基因。[关键词]RPS14基因；慢病毒

3、载体；骨髓增生异常综合征[中图法分类号][文献标志码]AConstructionandIdentificationofRPS14RecombinantLentiviralVectorLuoJing，JiangWen,LiuLin,WangLi(DepartmentOfHematology,FirstAffiliatedHospitalaof,Chongqingmedicialuniversity,Chongqinng,400016,China）[Abstract]ObjectiveToconstructalentiviralvectorofRPS14andobtaina

4、stablepackagingcelllines,andobserveitsexpressioninhumanMDScelllineMUTZ-8.MethodsRPS14wasobtainedwithreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR).ThentheRPS14genewassubcolonedintothelentiviralvectorpGC-FU,toconstructalentiviralvectorcarryingRPS14genenamedthevectorpGC-FURPS14,whichw

5、asconfirmedbyPCR,digestingandDNAsequencing.WiththehelpofLipofectamine2000,293TcellswerecotransfectedwithpGC-FURPS14,pHelper1.0andpHelper2.0.Thetiterofviruswastestedbyreal-timePCR.TherecombinantlentiviralvectorpGC-FURPS14wasusedtoinfecthumanMDScelllineMUTZ-8.ThetransfectionefficiencyandRP

6、S14mRNAexpressionsweredetectedbyflowcytometryandRT-PCRrespectively.ResultsTheconstructionofRPS14recombinantlentiviralvectorwasconfirmedtobeexactedbyPCRassay,digestingandsequencing;theassayedtiterofviruswas2.0×109Tu/ml.Thetransfectionefficiencywas68.4%,andstableexpressionofRPS14mRNAwasdet

7、ectedbyRT-PCR.ConclusionLentiviralvectorcarryingRPS14genehasbeensuccessfullyconstructed,whichiscapableofdeliveringthetargetgeneRPS14intohumanMDScelllineMUTZ-8foritsstableexpression.[Keywords]RPS14;LentiviralVector;myelodysplasticsyndromeSupportedbytheGeneralProgramof Nati