smac基因干扰慢病毒载体的构建及其在晶状体上皮细胞的表达

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterConstructionandexpressionofle僦usvectorparticleLV-SMAC．RNAiinthele辰奄pithelialcellg—ByJiangyuSupervisor：Prof．ZhengGuangyingOphthalmologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2013原创性声明Ⅲ洲咖㈣洲㈣㈣㈣IY2545699本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人

2、在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。⋯一：诱仁吼狒年s肌臼学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位

3、论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位做储：术气日期：沙防岁月毋摘要Smac基因干扰慢病毒载体的构建及其在晶状体上皮细胞的表达研究生蒋瑜导师郑广瑛郑州大学第一附属医院眼科河南郑卅I450052白内障是世界范围主要的致盲眼病，据预测到2020年每年会有2000—2500万患者需行白内障手术。这无疑会对社会和国家造成巨大的经济负担。因此，探求白内障的发病因素及发病机理，延缓和阻止白内障发生及发展显得尤为重要。国内外医学工作者尤其是眼科工作者为此做出了巨大的努力，并取得了令

4、人瞩目的成绩。近年来越来越多的证据表明晶状体上皮细胞(Lensepithelialcells，LECs)凋亡可能是各种非先天性白内障形成的细胞学基础。因此，检测年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞凋亡发生的分子机制，抑制品状体上皮细胞的凋亡过程，为延缓和阻止年龄相关性白内障的发生和发展提供了新的思路。线粒体蛋白Smac／DIABLO(secondmimchondfiflactivatorofcaspase／directIAPbindingproteinwithlowPI)，被称为第二线粒体来源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂，是一种存在于线粒体并且调节细胞凋亡的蛋白

5、质。既往研究显示在年龄相关性白内障中Smac可能参与了晶状体上皮细胞的凋亡过程以及白内障的形成。因此，如果能特异性沉默Smac基因，观察其下调前后晶状体上皮细胞内凋亡的变化，对白内障发病机制的研究具有重要意义。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在生物体内，内源性或外源性的双链RNA(double．strandedRNA，dsRNA)弓I起与其同源的mRNA特异性降解，导致转录后阶段的基因沉默。dsRNA经酶切后会形成很多小片段siRNA(SmallinterferingRNA，siRNA)，这些小片段siRNA是一种小RNA分子，一旦与信使R

6、NA(mRNA)中的互补序列互相结合，会导致整条mRNA失去翻译成蛋白质的功能，RNA干扰技术是一种强大的实验工具，能够高效、特异的使靶基因沉默。摘要本实验拟使用RNA干扰技术实现对Smac基因的特异性沉默，为进一步探索凋亡与白内障形成之间的关系奠定基础。研究目的构建针对Smac基因带有筛选标记的siRNA慢病毒载体并测定目的基因在晶状体上皮细胞中的表达情况，为利用RNA干扰(RNAi)技术探讨白内障发病机制与细胞凋亡的关系奠定基础。方法1．永生化人品状体上皮细胞(HLE．B3)的培养：将冻存的晶状体上皮细胞复苏后，放入含有20％胎牛血清的DMEM培养基中，置于含5

7、％C02、37。C的细胞培养箱内培养，取融合至90％的细胞用于实验。2．构建针对Smac的慢病毒载体，用于病毒的生产。3．设立空白对照组、阴性对照组和siRNA组，进行相应病毒感染，病毒感染细胞16h后换液，并在72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)在晶状体上皮细胞的表达。4．慢病毒感染细胞96h后提取细胞中的总RNA，做三次重复的实时定量多聚酶链式反应(Real．timePCR)。实验中我们采用家族管理基因GAPDH作为内参基因。结果(1)绿色荧光蛋白(GFP)在人晶状体上皮细胞中成功表达，在荧光显微