层粘连蛋白和matrigel对人胚胎干细胞源性神经上皮祖细胞向神经分化的影响

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1、层粘连蛋白和Matrigel对人胚胎干细胞源性神经上皮祖细胞向神经分化的影响胚胎干细胞源性神经上皮祖细胞向神经细胞的诱导分化建议修改：层粘连蛋白和Matrigel对人胚胎干细胞源性神经上皮祖细胞向神经分化的影响袁丁，林戈卢光琇（410078长沙，中南大学生殖与干细胞工程研究所，人类干细胞工程研究中心）[摘要]目的建立人胚胎干细胞源性的神经上皮祖细胞贴壁诱导分化的实验方法随标题修改。摘要的目的和结论应一致比较层粘连蛋白和Matrigel在人胚胎干细胞源性神经上皮祖细胞向神经细胞分化过程中的作用。方法人胚胎干细胞诱导分化的神经上皮祖细胞，比较其在两种细胞外基质：层

2、粘连蛋白和Matrigel处理的培养皿上贴壁增殖能力，免疫荧光染色检测神经上皮祖细胞标记Nestin和Musashi，神经元标记Tuj1和星型胶质细胞标记GFAP。结果神经上皮祖细胞在两种细胞外基质上贴壁率相近，但层粘连蛋白组的神经突起形成率和Tuj1阳性细胞比例分别为（97±2）%和（75±5）%，明显高于Matrigel组请列出关键数据以佐证的（89±3）%和（50±5）%。结论层粘连蛋白是神经上皮祖细胞向神经元分化的重要细胞外基质。[关键词]胚胎干细胞；神经分化；层粘连蛋白[中图分类号]Q2-33[文献标志码]B[基金项目]国家高技术研究发展计划（863

3、计划，2003AA205180，2006AA02A102）；国家重点基础研究发展计划（973计划，2005CB522705，2007CB947901，2007CB948103）；作者简介：袁丁，女，湖南长沙人，博士研究生，Email：dianayd66@yahoo.com.cn[通信作者]卢光琇，教授，博士导师电话：0731-84497661，E-mail:请补充lugxdirector@yahoo.com.cn人胚胎干细胞向神经细胞诱导分化被认为是胚胎干细胞用于临床替代治疗最有潜力的方向之一。目前，已有研究方法将人胚胎干细胞诱导成为神经上皮祖细胞或各种神经细

4、胞类型，除了采用添加多种细胞生长因子或基质细胞共培养的方法外，要提高神经细胞体外分化效率，细胞外基质也是重要的因素之一[1-4][1,2]。本文采用直接诱导的方法将人胚胎干细胞诱导为神经上皮祖细胞，通过消化成体积接近的小细胞团贴壁分化的方法，比较层粘连蛋白和Matrigel对神经上皮祖细胞贴壁分化扩增和神经元分化成熟的作用有否差异，以期建立一种简单高效的神经上皮祖细胞贴壁诱导方法，为特定细胞类型的诱导分化提供技术平台和细胞来源。1材料方法1.1细胞系人胚胎干细胞为chHES-8和chHES-22两株胚胎干细胞系补充来源或标文献[5]，常规培养在人胚胎成纤维细胞

5、制备的饲养层上。培养基为：培养基为人胚胎干细胞培养基：DMEM/F12，15%KnockoutSerumReplacement，0.1mmmol/β-巯基乙醇，1mmol/LL-谷氨酰胺，1%非必须氨基酸，4ng/ml成纤维细胞生长因子2。1.2主要试剂　DMEM/F12(1∶1)培养基、KnockoutSerumReplacement、N2添加剂、AlexaFluor抗小鼠488、抗兔594(Gibco公司,USA),成纤维细胞生长因子2(R&D公司,USA),脑源性神经营养因子、胶质源性神经营养因子（Biosource公司，USA）,维生素A、环腺苷酸（S

6、igma，USA），小鼠抗人Nestin、兔抗人Musashi、小鼠抗人Tuj1、小鼠抗人Otx2、兔抗人酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase,TH）、小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、Otx2第1次出现的缩写应按中文名（英文全名，缩写）的格式(Chemicon公司，USA)。1.3方法1.3.1人胚胎干细胞向神经上皮祖细胞的诱导分化传代培养至第4~5天的人胚胎干细胞，将用于神经上皮的诱导分化研究。诱导方法为，将培养基更换为神经诱导培养基：DMEM/F12，1%N2supplemen

7、ts，1mML-谷氨酰胺，1%非必须氨基酸，添加4ng/ml成纤维细胞生长因子2。在饲养层细胞上培养10d，大量的神经上皮“rosette”结构出现提示神经上皮祖细胞的产生。1.3.2神经上皮祖细胞的贴壁分化将分化第10天的克隆机械切割成细胞团，于添加20ng/mlFGF2的神经诱导培养基中，悬浮培养4～5d。收集细胞团于1.5ml离心管中，室温下待其自然沉降5min，去除残余培养基，添加1000μlHank’s平衡盐溶液，37℃培养箱中孵育10～15min，200μl加样器枪头轻轻吹散细胞团，使其成为直径为100～200μm左右的小细胞团，新鲜培养基洗涤1次

8、，重悬细胞，将其在15μg/ml多聚鸟