ra序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响

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郑州大学2008届硕t..学位论文中文摘要RA序贯诱导组之间无显著性差异(尸>0.05)。W七stem七lot检测显示:未分化ESCs中表达4.IN和4.IB蛋白，诱导分化后两者表达量都增加。结论1.RA序贯诱导法可在ESCs分化后第7d获得神经元样细胞，较4一/4+诱导法提前3d，且两者的NSE和GFAP阳性细胞率无差异，因此RA序贯诱导法可作为经典的4一/4+诱导法的替代方法。2.4.IN和4.IB蛋白的表达量随着ESCs分化为神经细胞而增加。关键词:胚胎干细胞;分化:维甲酸;神经细胞;4.1蛋白 郑州人学2008届硕l研究生毕业论文英文摘要RA一treatedSequentialMethodIndueedEmbryonieStemCellsDifferentiationintoNeuralCellsandtheExPressionChangeofProtein4.1aftertheInduetionPostgr时uateJiangYuanyUanTutorXingYingDeP良rtmentofPhysiology，theBasieMedicalCollegeofZhengZhouUniversityZhengZhou，Henan，450052AbstraCtEmbryoniestemcells(ESCs)whiehderivedfromtheinnereellmass(ICM)ofblastoeyst一stageembryoshavetheabilitytoProliferateindefinitelyinvitroandthePluriPoteneytodifferentiateinto’anyeellt冲ederivedfromeetoderm，mesodermorendoderm·Lot景ofreportsindicatedthatESCseouldbedireetionallydifl触rentiatedintoneuraleellsinsPeeifieindueedsystemwhiehProvidedPraetiealevideneesforthetransPlantationofESCstotreateenternervoussystemdiseases.Sofar，themethodsusedtodirectionallyindueeESCsdifferentiationintoneuraleellsinelude4一/4+assay，five一stePmethod，SDIA(astromalcell一derivedindueingaetivity)，adherentmonoculture，genemethods，and50on.4一/4+assay15themostclassiealmethod.However，ESCsmustformemb理oniebodies(EB)beforeinduetedbyRAwhiehmakesitdiffieulttocontrolandanalyZetheProeessofinduetion.Moreover’thismethodrequireslongculturetime，comPlieatedmaniPulationandstricteultUreeonditionineludingeelldensity，nutritionandequiPments.SearchingforanewinduetionmethodtoshortentheinduetionPeriodandsimPlifymaniPulationwillimProvethestudyonESCseultureanddifl笼rentiationinvitro.It15uneertainaboutthemechanismofESCsdifl七rentiationintoneuralcellsPresently.ManyresearehersfoundthattheexPressionofsomeProteininereased(i.e.PKC6andPKC。)ordecreased(i，e.notchl)duringneuraleellsdifl七rentiation.StudyaboutratPC12eelldifferentiationandmouseeerebellumneurondeveloPmentrevealedthattheIV丫 郑州大学2008届硕!:研究生毕业论文英文摘要exPressionamount，altemativesPlieingandlocationofProtein4.1changedaiongwiththedifferentiationofneuraleells.Butit，5unelearabouttheexPressionchangeof4.1ProteinintheProeessofdifferentiationESCsinioneuraleells.objeetive1.TodeveloPanewmethodtoindueeESCsdifferentiateintoneura】eellsinvitro，therebyshortendifferentiatedtimeandsimPlifymaniPulation·2·TOstudytheexPressionofProtein4.lNand4.lBduringdifferentiationofESCsintoneuraleellsinvitro.MethodSESCswereofferedbyZhengZhouUniversitystemeellslaboratory.Afteranabiosis，ESCswereseededonamitonycinC一别汀estedMEFmonolayerandeultUredwiththeMEFconditionedmediumconiainingLIF.AsESCsgrowthstably，rePlantthemoneulturePlastiedishesatadensity(105/ml).下比ee脚叩5weresetas伪llows:(l)eontrol脚即:EsCswereseededinEBeulh甘emediumandeulturedwithoutanadditionalrevulsant.(2)4一/4+indueedgouP:ESCsweresusPendedinEBeulturemediumfor4dtoformEB，d丽ngwhiehshookev恻2一3htoavoidEBadhesion.onsthd出eeellswereeolleet司ands喇edonglutin一coatedeultureplastiedishesin.induetionmedium(containing10七mol/LRA).ExchangewithEBeulturemediumafter4d.(3)RA一treatedsequentialindueed脚即:EsCswereseededininduetionm“ium(eontaining10一6mol/L队)direct一yAfter48h，everydishwasadded3mlneura】stemeellsculturemedium(containing20林g/LbFGF，2%B27，l%NZ，DMENfF12withoutFBS).AfterZd，everydishwasadded1mlneura】eelleulturemedium(containingZ%B27，15%FBS，DMEM用12)ev卿da丫on7thdthem比iumwasexchangewithneuraleelleu一turem比ium.InvertedmicroscoPewasusedtoobservetheshaPeofESCsduringdifl笼rentiation.IrnrnunoeytochemiealstainingwasaPPliedtocalculatethepositiveperC即ta罗ofNsEandGFAppositiveeellsrespeetivel丫Westem一blotwasusedtostudythe4.1Nand4.IBexPressionamount.ReS川tsUnderinvertedmicroscoPe，MEFwasfusiformandadherent.The 郑州大学2008届硕卜研究生毕业论文英文摘要undifferentiatedESCsgrewineolonieswithhighrefraetion.Afterdifferentiationfor10d，theeellsineontrolgrouPwerealmostePithelial一likeeells，s议汀oundedbyafew允51伪rmeells.In4一件+indue记脚uP，aner12hadhesiononsthd，some几51伪rmeel一5migated加mundi衡entiat记Eseseolonies;onlothd，neural一likeeellswereobservedwithslenderProeessestoformnetwork.InRA一treatedsequentialindueed『o即，neural一likeeellswi止slenderprocesseswereobservedonsthd.s曲s叫uentl%thenumberofneural一likeee一15inereasedobviousl丫on7thdtheeellsdisplayed小inlongbiPolarormultiPolarProeessestoformnetwork.Afterdifferentiationfor10d，NSEPositiveeellratesofeontrolgrouP，4一/4+indueedgrouPandRA一treatedsequentialindueedgrouPwere11.8%士1.8%，50.6%士2.7%and57.6%土1.4%.GFAPPositiveeellrateswere19.0%土2.9%，36.0%士2.5%and33.0%士2.0%，seParately.StatistiesanalysisshowedthatthereareProminentdiffereneebetweeneontrolandeitherinduetiongrouP(P<0.01)whilenoProminentdifl贻reneebetweenthetwoinductiongrouPs(P>0.05).W七stem一blotshowedthat4.INand4.IBwereexPressedinundiff改entiatedESCsandboththerninereasedafterinduetion.Conclusions1.R^·treatedsequentialindueedme仇odeangetneuron一likeeellson7thd，3dbefore4一/4+assay.NSEandGFAPPositiveeellPereentageshavenodiffereneebetweenthetwogrouPs.50RA一treatedsequentialindueedmethodeanbeusedtorePlaeeelassieal4·/4+assay.2.Thelevelof4.INand4.IBinESCsinereasesd丽ngdifl笼rentiationintoneuraleells.Keywords:Embryoniesterneells;difl七reniiation:retinoieaeid:neuraleells:Protein4.1士 目录正文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响……l前言......................................................................................................……1材料与方法..............................................................................................……2讨‘论....................................................................................................……17结论...................................................................……，...……，...............……26参考文献................................................................................................……27综述胚胎干细胞体外分化的研究进展...............................……，.........................……32参考文献....……，.....................................................................................……44附录中英文缩略词表...........................................................................................……51致谢...........................................................................................................……52 郑州大学2008届硕七学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎十细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响研究生姜媛媛导师邢莹教授郑州大学基础医学院生理学教研室河南郑州450052前性旨口胚胎干细胞(。刀bryonicstemeells，EsCs)是从早期囊胚的内细胞团(innerceUmass，ICM)分离出来的一种多能细胞系;它能在体外长期不断自我更新，并保持多向分化潜能，可以分化为内、中、外三胚层来源的几乎所有类型的细胞。1981年，Evans和Martin[’，2]，分别从小鼠囊胚的内细胞团和生殖蜡成功地获得多潜能干细胞。1998年，美国Wisconsin大学Thomson等l3]成功地从人囊胚的内细胞团中分离出了人类第一株ESCs给医学界带来前所未有的冲击，ESCs成为生命科学的研究热点。己有研究表明，ESCs在特定的诱导培养体系中，可被定向诱导分化为神经细胞，为ESCs的移植治疗神经系统疾病提供了实践依据。迄今为止，体外诱导法主要有4一/4+法t4]、五步法[5]、基质细胞诱导法[6]、单层粘附培养法[7]和基因修饰法l8]等。其中，4一/4十法是最经典的诱导法，但该方法使用维甲酸(retinoi。。cid，’队)诱导前需形成类胚体(emtr卿ni。bodies，Es)，使分化较难控制和分析，且培养时间长、操作复杂，对细胞密度、营养和设备等培养要求较高。探索新的细胞诱导方法用以减少诱导时间、简化操作将促进ESCs体外培养分化的研究。目前对ESCs分化为神经细胞的机制仍不清。有报道称，在ESCs向神经细胞分化过程中出现某些蛋白的表达增高(如PKC6和PKc尸])或者降低(如notchl[’0])。4.1蛋白【”，’2]是一种细胞骨架蛋白，对维持细胞形态具有重要作用。在对大鼠嗜铬神经瘤PC12细胞分化和小鼠小脑神经元发育的研究中均发现细胞骨架蛋白4.1蛋白的表达量、剪切形式和细胞定位会随着神经细胞的分化而改变[’3一161。但4.1蛋白在Escs向神经细胞分化过程中的改变尚有待研究。夕 郑州大学20佣届硕士学位论文R^序贯诱导小眼胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响材料与方法1.实验材料Ll实验动物:昆明小鼠由郑州大学实验动物中心提供，用于获取滋养层细胞。小鼠胚胎干细胞系由郑州大学医学院干细胞中心建立并保存。1.2主要实脸试剂高糖DMEM培养基美国Gibco公司胎牛血清(FBS)杭州四季青生物公司维甲酸(RA)美国sigma公司p一琉基乙醉(p一ercaPtoethanoD美国成glna公司丙酮酸钠美国aigma公司非必需氨基酸(NEAA)美国访访如gen公司丝裂霉素C(MMC)浙江海正制药厂胰蛋白酶美国Am找活co公司乙二胺四乙酸(ED下A)美国Ami铭co公司多聚赖氨酸(Pol梦L-幼sine)北京中杉生物公司DMEM压12培养基美国GIBCO公司B27美国GIBCO公司N2美国GIBCO公司碱性成纤维生长因子(bFGF)美国sigma公司青/链霉素浙江海正制药厂特异性烯醇化酶伽sE)多克隆抗体北京中杉生物公司胶质纤维酸性蛋白(G刊J)多克隆抗体北京中杉生物公司巢蛋白(nestin)单克隆抗体北京中杉生物公司4.IN、4.IB多克隆抗体美国纽约血液中心安秀丽博士惠赠RabbitSP试剂盒北京中杉生物公司卜朗血单克隆抗体北京博奥森生物公司DAB显色试剂盒北京中杉生物公司 郑州大学2008届硕十学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响1.3主要仪器医用净化工作台苏州高新净化工程有限公司低速离心机TD卜4OB，上海安亭科学仪器厂高速离心机TGL一16G，上海安亭科学仪器厂恒温箱K一SD型，上海森信实验仪器有限公司干燥箱101一3一BS.n，上海跃进医疗器械厂倒置显微镜(图像采集系统)IX一71，JaPanol丫mpus普通显微镜CX一21，J即anol，mpusC02培养箱IGO一150，FraneeJouan高压自动消毒柜HvE一50，JaPanHirayama电子分析天平BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司自动双重纯水蒸馏器52一93，上海亚荣生化仪器厂紫外线分光光度仪U·2001型，JaPanHITACHI电热恒温水槽DK一SD型，上海森信实验仪器有限公司电泳仪DYY-llB型三恒电泳仪，北京六一仪器厂1.4主要试剂的配制一4.1普通PBS:NaCI8.09，KCI0.29，N处HPO4·12H203.479，KHZPO40.29加三蒸水至1000ml，充分溶解后，调整pH值至7.2，过滤后分装入250ml盐水瓶中，室温保存。使用前高压121℃，21min蒸汽消毒。1.4.20.01MPBs:NaHZPO4·2H2031.29，N处HPo4·12HZo71，639，溶解于1000ml三蒸水中，制成0.2M的母液。取0.2MNaHZPO4溶液9.5ml，0.2MN处HPO4溶液40.5ml，混合后加入NaCI8.59，加三蒸水至1000ml，充分溶解，调整pH值至7.4，分装备用。1.4.3nMEM培养基:将高糖DMEM13.59，N水co33.749和HEpEs2.gg充分溶解于1000ml消毒三蒸水中，用1NNaoH或1NHel调pH值至7.1，0.22林m滤膜过滤灭菌，分装到至100ml消毒盐水瓶，封好，一20℃冻存。1.4.4DMEM/F12培养液:DMEM/F1212.09，NaHCo33.749，充分溶解于1000ml消毒三蒸水中，用1NNaoH或1NHCI调pH值至7.1，0.22娜微孔滤膜过滤灭菌，分装至100ml消毒盐水瓶，封好，一20℃冻存。 郑州人学2008届硕_!:学位论文RA序贯诱份小限胚胎十细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的彬响1.4.5细胞消化液:0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA:称取0.259胰蛋白酶置于烧杯中，先加入少量PBS调成糊状后，再添加PBS至100而混匀，4℃过夜，次日称取0.029EDTA于胰蛋白酶溶液中，充分溶解后用NaHC03调pH值为7.2，0.22户m滤膜过滤除菌，一20℃保存。1.4.6丝裂霉素c工作液:将2mg丝裂霉素c溶解于5ml消毒三蒸水中，配制成0.4m创ml的母液，于4℃避光保存。使用前，用MEF培养基稀释40倍配成终浓度为ro林创ml的工作液，即5ml培养基加125川母液。工作液于4℃避光保存，Zw内使用。1.4.70.5%明胶溶液:称取明胶5.09，加三蒸水1000ml，65℃30min水浴，使明胶溶解，迅速用0.22林m滤膜过滤消毒(温度下降后难以过滤)后，于4℃保存备用。明胶预先包被培养瓶(皿)的处理方法:将0.5%明胶水溶液加入培养瓶(皿)内，能覆盖培养瓶(皿)底部表面即可，在室温下或培养箱内静置1h以上。使用前，吸弃明胶溶液，PBS洗涤1次。1.4.8双抗溶液:取消毒三蒸水160ml，加入青霉素钠160万u1.09，混匀，弃去60ml，再加入链霉素100万u1.09，混匀后过滤分装，·20℃冻存，备用。1.4.94%多聚甲醛:三蒸水50ml，加多聚甲醛4.09，加热至40一50℃，溶解后加0.01MPBs至100ml，调pH至7.4一7:6，过滤后4.c保存备用。1.4.10各种培养液组分1.4.10.1MEF培养基:高糖DMEM、10%FBS、1%双抗。1.4.10.2Eses培养基:条件化培养基(eM)、s%FBs、0.1mmo比p一琉基乙醉、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠。1.4.10.3EB培养基:高糖DMEM、20%FBS、l%双抗、0.1mmoFLp一疏基乙醉、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠。1.4.10.4诱导培养基:EB培养基加入10石moFLRA。1.4.10.5神经细胞培养基:DMEM下12、15%FBS、2%B27。1.4.10.6神经干细胞培养基:nMEN‘F12、2%B27、10，0NZ、20林岁LbFoF。1.4.11认lestem一blot相关溶液1.4.11.140%Arc汤is贮液:丙烯酞胺20.09，N，N亚甲双丙烯酞胺0.549，三蒸水20ml，混匀搅拌，溶液澄清透明后，再用三蒸水稀释至50ml，过滤后4℃避光保存，lm内使用。1.4.11.2浓缩胶缓冲液(o.x56MTris一HcL，pH6.8):Trisl.883g，sDso.125g， 郑州大学2008届硕十学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎+细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响双蒸水50ml，用浓盐酸调节pH值至6.8，再用三蒸水定容至looml，4℃保存。1.4.11.3分离胶缓冲液(0.75MTris一HCL，pHS.8):Trisg.o6g，sDSo.lg，双蒸水50ml，用浓盐酸调节pH值到8.8，再用三蒸水定容至100ml，4℃保存。1.4.11.44x样品缓冲液:Triso.96g，甘油16ml，sDs3.2g，加入三蒸水至40ml，4℃保存，临用前加入p一琉基乙醇，终浓度为10%。1.4.11.510%过硫酸钱(AP):APo.lg，三蒸水lml，混匀，充分溶解，用前配制。1.4.11.6sx电泳液:Tris15.19，甘氨酸94.09，sDs1.09，加三蒸水稀释到250ml，pH滴定至8.3，4℃保存，用前稀释5倍。1.4.11.7丽春红染色液:丽春红1.09，三氯乙酸15.09，磺基水杨酸15.09加三蒸水稀释至50ml，用时稀释10倍。一4一1.8转膜缓冲液:甘氨酸2.99，Tris5.89，sDs0.379，20%甲醇，加三蒸水800ml，调节pH为8.3·8.4，然后定容至1000ml。1.4.11.9TBs:Tris1.219，Nael4.og，稀释至sooml，浓盐酸滴定pH至7.6，然后用三蒸水定容至1000ml。1.4.11.10封闭缓冲液:脱脂奶粉1.09加入20m1TBS中，微波炉加热，使完全溶解。1.4.11.11考马斯亮蓝染色液:R一2500.259，甲醇50ml，冰乙酸10而，三蒸水40ml。1.4.11.12脱色液:甲醇45ml，冰乙酸10ml，三蒸水45ml。1.4.11.13分离胶及基层胶配制:10%SDS.PAGE配置分离胶印H=8.8)‘基层胶(PH=6.8)40%Are/b15Zml0.5mlddHZOZml0.5mlTriS4ml4ml10%AP30闪20林l介med8林l4林l2.实验方法 郑州大学2008届硕_卜学位论文RA序贯诱泞小鼠胚胎+细胞向神经细胞分化及对4.1蛋自表达的影响2.1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)制备及丝裂霉素C(MMC)处理2.1.1取妊娠14d左右昆明小鼠，颈椎脱臼处死，紫外线灯照射下，75%酒精浸泡20min，无菌操作下打开腹腔，取出子宫，分离各个胚胎组织，放入已加20而PBS的平皿中，撕去胎膜，去除头部、内脏和四肢。PBS漂洗3次，转入50mi三角烧杯中，用弯剪剪成1~，左右的组织块。用吸管吸取组织块，均匀摆放至培养面积为100clnZ细胞培养瓶中，每块间距Slnln左右。组织块放置好后加入1mlMEF培养基，可保持组织湿润即可，在5%CO:培养箱中37℃培养，24h后补加少许培养基;第4d换液，加入3一4ml培养基;第7一sdMEF生长达90%融合时进行消化传代，每3一4d传代1次。2.1.2取第3代MEF生长达100%融合时，PBs漂洗3次，换为含10林创m】MMe的MEF培养液。在5%COZ培养箱中37℃培养2.5h后，弃含有MMC的培养液，用PBS洗涤5次。2.1.3常规消化MMc处理后的MEF后，按1:1.接种于预先用明胶处理过的培养瓶内，待细胞充分贴壁后，将制备好的饲养层细胞放置于培养箱中备用。若细胞密度过低，需补种MMC处理过的细胞，以保证细胞能连成一片而没有间隙。接种后的MEF在7d内使用，使用前要更换为ESCs培养基。2.2收集条件化培养基(。onditionalme山um，CM)和制备ESC。培养基取一部分MMC处理后的MEF，加入5mlMEF培养基，每3d收集l次。进行ESCs复苏前，至少收集1000ml备用。CM使用前，按比例加入各种成分:FBs、p一疏基乙醇、非必需氨基酸和丙酮酸钠，即制备成Escs培养基，1000rpm，离心5min，以去除剩余的组织块和细胞碎片，0.22林m滤膜过滤除菌。ZJESCs复苏和冻存2.3.1利用37℃水浴，快速溶解冻存管中ESCs(约1min)，吸取细胞悬液逐滴缓慢加入己含20mlESCs培养基且己接种MEF的100cmZ培养瓶中，轻轻吹打培养基，使细胞集落相对分散。待12h后，具有活性的ESCs已贴壁，弃去培养基，加入15ml新鲜ESCs培养基。2.3.2每天观察细胞，ESCs对酸性环境敏感，易坏死，所以当培养基颜色变为橘黄色时即半量换液，使ESCs所在的新环境更接近与原来的微环境。当长成多个集落后，一般达70%密度即可传代，在传代前6h重新换液。传代前，先用PBS漂洗3次，再加入1ml0.25%胰酶/0.02%EDTA消化液，摇晃2次，使消化液 郑州大学2008届硕士学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响浸润瓶底，立即吸弃，掌握好消化时间，以ESCs集落松动而MEF仍贴于瓶壁为最佳效果，加入5mlESCs培养基终止消化。吸管轻轻吹打若干次，使消化下来的细胞分散，保证单细胞悬液。以1:3一1:6比例传代接种于已铺板的MEF饲养层上，第Zd全量换液，以后1一Zd半量换液。2.3.3将欲冻存ESCs去除废旧培养基，加入新鲜培养基。6一12h后，吸弃培养液，PBS漂洗2次，加入1ml消化液，消化时间与传代相同，加入3mlESCs培养基终止消化，移入10ml离心管，1000印m，离心5min，弃上清，加入适量预冷的冻存液(40%ESCs培养基、‘50%FBS和10%DMSO)，计数调整细胞密度为1护个/m1。将细胞悬液转入冻存管，做好标记后4℃放置30min，转移到一20℃放置3一4h，再转移到一70℃冰箱过夜，第Zd转移到液氮罐中。2.4ESCs纯化取一瓶密度约70%ESCs，PBS漂洗3次，加入1ml0.25%胰酶/0.02%EDTA消化液，摇晃2次后立即吸弃，加入10mlESCs培养基，充分吹打混匀后匀后，以1:2比例置于明胶包被的100emZ培养瓶，以增加培养空间，防止ESCs集落叠加而提早贴壁。利用差速贴壁法纯化ESCs，MEF45min左右时开始贴壁，2一3h90%以上MEF可贴壁，而ESCs3一sh才开始贴壁，所以2.5一3h时收集培养瓶内的上清液即为ESCs悬液。为保证纯化效果，将收集时间延长至4h，此时己有部分ESCs贴壁。若储备细胞量充足，贴壁的ESCs可弃去。2·5ESCs诱导分化将纯化后ESCs用不同培养基重悬后，进行台盼兰活细胞记数，调整细胞密度，以1护个/m1接种至置有涂布多聚赖氨酸玻片的直径3.scm培养皿中。2.5.1实验分组对照组:用EB培养基重悬。ESCs自然分化，不加入任何诱导剂，不更换任何培养基。每2一3d换液1次。4一/4+诱导组:用EB培养基重悬。悬浮培养4d，每2一3h摇晃1次，防止EB贴壁，每天半量换液1次，换液前将培养瓶竖立，静置10min，让EB沉淀到瓶底，然后小心吸去上层部分液体，再加入等量新鲜培养基;第sd收集细胞，700nnp，离心5min，用诱导培养基(含10一6mol/LRA)重悬，接种至明胶包被的直径3.scm培养皿继续培养4d，隔天换液;第gd，弃去诱导培养基，PBS漂洗2次，加入EB培养基，隔天换液。 郑州人学2008届硕_l:学位论文RA序贯诱学小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的彭响RA序贯诱导组:用诱导培养基(含10七moFLRA)重悬，使用明胶包被的直径3.scm培养皿，作用48h。此时，大多数细胞己贴壁，PBS漂洗2次，加入3mL神经干细胞培养基(含20林留LbFGF、2%B27、l%NZ的无血清DMEM压12培养基)，培养Zd;此后每天加入1mL神经细胞培养基(含2%B27、15%FBs的DMEM/F12培养基)，直到第7d弃去，PBS漂洗2次，用神经细胞培养基培养，隔天半量换液。各组细胞均培养10d，倒置显微镜下观察ESCs生长速度、变化形态和分化过程中细胞形态变化，并于分化后第2、3、5、7、10d拍照。2.5.2神经细胞的免疫细胞化学鉴定取出ESCs和分化后第4dRA序贯诱导组的细胞玻片进行免疫细胞化学染色。分化后第10d分别取出每组培养皿中的细胞玻片进行免疫细胞化学染色。具体操作如下:(l)0.01MpBs漂洗3minx3次。(2)4%多聚甲醛室温固定巧min。.(3)0.01MPBS漂洗3minx3次。(4)3%HZ仇室温作用10min，灭活内源性过氧化物酶。(5)0.01MPBS漂洗3minx3次。(6)滴加封闭用正常山羊血清工作液一滴，室温作用20min，以封闭多余的生物素位点，滤纸吸液，不洗。(7)滴加一抗:每张玻片上滴加兔抗人nestin多克隆抗体(l:2oo)40川，兔抗人NSE和GFAP多克隆抗体工作液一滴，置于湿盒内4℃过夜。(8)0.01MPBS漂洗3minx3次。(9)滴加生物素化二抗工作液一滴，室温作用10min。(10)0.01MPBS漂洗3minx3次。(11)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液一滴，室温作用10min。(12)0.01MPBS漂洗3minx3次。(13)DAB显色，镜下观察显色结果，待出现特异性显色时，自来水冲洗终止显色。 郑州大学2008届硕士学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响(l4)梯摩酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。2.64.IN和4.IB蛋白免疫印迹2.6.1提取各组细胞蛋白取纯化后ESCs和分化后第10dRA序贯诱导组细胞各一瓶，将培养液弃去，用预冷的PBs清洗细胞两次，弃去PBS，加入400川细胞裂解液，轻轻摇动2min，用细胞刮将贴壁的细胞刮下来，转移至1.5mlEp管中，加入1/3体积4‘上样缓冲液，沸水浴10min，12000rpm，离心15min，取上清，进行蛋白浓度测定。2.6.2样品蛋白质含量的测定(l)蛋白样品进行适当稀释(样品各取5川，与蒸馏水45川混合进行稀释)(2)将BsA标准蛋白进行稀释，制成蛋白浓度为8，4，2，1和0.5林创川标准蛋(标准PaPS林l+蒸馏水45卜l)(3)将蒸馏水、稀释后的蛋白样品和稀释后的标准蛋白分别加入%孔板内，各设3个平行孔。加入蒸馏水的3个平行孔作为空白对照。稀释后的标准蛋白按蒸馏水和稀释过的蛋白样品各按5闪/孔加入。(4)按50:1比例将试剂盒中A液和B液进行混合。将混合液加入%孔板中，每孔加入100林l。(5)37oC避光孵育30min。(6)用紫外分光光度计检测OD562。(7)根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。2.6.3免疫印迹法(1)灌胶和上样:安装固定好电泳装置后，将配好的分离胶溶液平稳地注入两玻璃板间隙，再在液面上小心加入薄层双蒸水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置约30min;待分离胶凝固后，吸去其上的水层，再注入浓缩胶溶液，然后小心插入梳子并注意不要在齿尖留有气泡，静置15min左右，待浓缩胶聚合后，把电泳装置放入装有电泳液的槽中，在内槽中加入电泳液，并没过内玻璃板，拔去梳子。(2)样品的处理及上样:从冰箱中取出样品，加入相应体积浪酚蓝(终浓度0.2%)和p一ME(终浓度10%)，置水浴锅中水浴煮沸3一5min.用微量加样器 郑州大学2008届硕_卜学位论文RA序贯诱学小限胚胎十细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的形响取样品加入各个泳道，加样体积视不同组蛋白含量而定，以保证各组加样蛋白总量一致。(3)蛋白的电泳分离:加样后先用恒流(10m刀胶)电泳约36min，待澳酚蓝指示剂电泳至浓缩胶与分离胶交界处呈线状时，改为恒压(loov)电泳约60min至澳酚蓝到凝胶底部。(4)转膜:电泳结束后，根据上样情况和蛋白质分子量切取适当大小的长方形分离胶，至电转液中浸泡。剪同样大小的6张中性滤纸和硝酸纤维膜，硝酸纤维膜用甲醇浸泡数分钟后，置入电转液中，‘而中性滤纸则直接放入电转液中浸泡数分钟后开始转膜，由正极至负极分别是滤纸3层、膜、胶、滤纸3层，各层边缘对齐，用玻棒赶尽气泡，湿转，在内槽中加入电转液，没过电极，以276mA电转60min。(5)免疫印迹:转膜完毕，以双蒸水清洗膜1一25，把膜放入丽春红染液中数秒后，取出以水漂洗，并观察蛋白条带，剪除多余的膜，再将膜清洗至颜色完全消退。把膜放入封闭液中，摇床上摇动封闭lh;把膜置入以封闭液稀释的兔抗鼠4.IN和4.IB多克隆抗体(l:200)中，4℃孵育过夜或37℃孵育Zh。用TBS洗膜3次，每次5min，把置入以封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(l:200)，室温孵育lh;TBS洗膜3次，每次1Olnin。(6)DAB显色:将膜放入配置好的DAB显色液中显色15mi六左右，待出现特异性染色后自来水冲洗。(7)蛋白条带密度分析:将显色后的膜用凝胶成像仪拍照，全自动图像分析系统计算各目的蛋白条带与p·actin条带光密度比值，计算各条带密度相对值。2.7统计学分析数据记录采用见士S表示，采用SPSS10.0软件分析。免疫细胞化学统计分析在光学显微镜下(、100)随机计数10个视野中的阳性细胞数(DAB显色，胞浆和轴突棕黄色为阳性细胞)，计算阳性细胞百分率，复片·5次。组间比较用单因素方差分析，以尸<0.05为差异有统计学意义。Westem七lot统计分析计算目的蛋白条带与p一actin条带密度的比值，重复测量5次。4.IN和4.IB在分化前后表达量的变化用配对t检验分析，以尸<0.05为差异有统计学意义。 郑州大学2008刷倾士学位论文RA厅，贯诱导小鼠胚胎r-细胞向神纤细胞分化lJI..对1.1蛋白表达的影响结果1.MEF滋养层细胞的培养MEF滋养层细胞表现为梭形细胞，具有贴壁生长的特点。按每只孕鼠平均10个胚胎，采用传统的消化培养法，可获得3瓶(100cm2培养瓶)细胞，取培养第7dMEF.台盼蓝计数为105/ml;用组织块培养法可高效的获得MEF.可获得到瓶(100cm2培养瓶)细胞，取培养第7dMEF.台盼兰计数为107/ml。如图10图1使用两种原代培养法的MEF(x)∞)A:组织块原代培养法MEF培养3d(黑箭头为组织块)B:组织块原代培养法MEF培养7dC:消化培养法MEF培养3d消化培养法MEF培养7d2.ESCs复苏和培养ESCs用条件培养基培养在接种MEF滋养层细胞的培养瓶内，由于MEF可以分泌LIF抑制ESCs的分化，而且收集的条件化培养基内也含有MEF分泌的LIF.在两种因素的作用下ESCs呈克隆样生长，生长迅速，形成的克隆结构均匀，呈11 郑州大学2008届硕十学位沦文RA序贯诱导小鼠胚胎}细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响椭圆或圆形，个别克隆呈不规则团块，边缘光滑且具有折光性，细胞排列紧密，细胞间界限不清，呈未分化状态。如图2。图2不同时期的ESCs^:义苏后ESCs培养ld(x100)B:义苏后ESCs培养4d(xl0())C:纯化前ESCs(x4())3·ESCs的纯化根据ESCs与MEF贴壁时间不同，用差速贴壁法将ESCs与MEF分离。为排除MEF对分化的影响，延长收集ESCs悬液时间(2.5一3h)，改用4h时收集。此时，全部MEF已贴壁，部分ESCs亦已贴壁并聚团，因此可获得更纯的ESCs。如图3。图3按不同差速贴壁时间进于J;ESCs纯化(K100)A:差速贴壁3h，MEF已贴壁，ESCs尚未贴壁B:差速贴壁4h，MEF己贴壁，部分Escs贴壁并开始聚团(黑色箭头为刚形成克隆的Escs)4.ESCs诱导分化 郑州大学2008届硕十学位沦文RA序贯诱导小鼠胚胎}几细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响对照组:自由分化第Zd，部分细胞已贴壁，自发形成EB;第4d，细胞己全部贴壁，大部分克隆团开始有梭形细胞爬出，带有短小的突起;第6d，大部分克隆团周围开始出现小圆形高亮度的上皮样细胞，外周仍为梭形细胞;第10d，克隆团边缘几乎均为密集的圆形高亮度的上皮样细胞，连成大片，外周为少量梭形细胞。4一/4+诱导组:分化第Zd，大部分ESCs经过悬浮培养，形成EB，由多种分化成熟度不一的细胞混杂，其表面较ESCs克隆表面粗糙，颗粒状明显细胞生长速度减慢。第3d，贴壁的EB增多，其周围有毛刺状突起，仍悬浮的EB开始囊性变;第sd，可见梭形细胞爬出，但整个培养皿中的细胞形态的改变不同步，仍可见很多未分化细胞团，个别EB绕以大量的梭形细胞，其突起相互连接，形成小的神经样网络;第7d，EB变扁平，克隆周围的神经样细胞增多，其突起逐渐变长、变细，细胞碎片增多;第10d，神经样细胞突起细长并形成网络。RA序贯诱导组:诱导分化第Zd，细胞已基本贴壁，形成形状不规则的小克隆，个别克隆外围可见散在的神经样细胞;第3d，细胞呈多边形或三角形由克隆向外伸展;第4d，细胞数量明显增多，部分细胞仍聚集为克隆团，但其周围细胞开始逐渐伸出突起，向四周伸展，偶见丝网状连接，从整体来看，细胞形态多样，并非一致;第sd，神经样细胞突起逐渐变长、变细，与邻近细胞交织成网，克隆中央未分化的细胞死亡脱落增加:第7d，神经样细胞形成网络，神经样细胞多呈双极性，胞体圆亮，两极各有一细长突起，甚至可见比胞体长约5倍，亦可见细胞胞体呈多边型，有多个短突起，从整体来看，细胞形态已趋于一致，大部分为单一密集的神经样网络;第10d，细胞形态与第7d相似。对照组、4一/4+诱导组和RA序贯诱导组细胞生长情况如图4。 郑州大学20佣闹颐卡学位论文阳序员诱导小鼠肌胎1'.细胞向神经细胞分化且对4.1蛋白表达的影响国4fitJ窗微镜下得组细胞分化小同时间的形态变化(x100)A:对照组B:4-/4+诱导组C:RA厅，贯诱导组14 郑州大学20呢届硕十学位沦文RA序贯诱导小鼠胚胎!几细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的形响5.免疫细胞化学鉴定结果对ESCs和分化第4d后RA序贯诱导组的细胞爬片进行免疫细胞化学染色，ESCs未表达神经干细胞标记性蛋白巢蛋白(nestin)，胞浆未显现棕黄色，无阳性细胞。而分化第4d后RA序贯诱导组细胞无论是聚团细胞还是散在细胞，已有部分表达nestin，细胞团表现为均匀的棕黄色，散在细胞胞浆呈棕黄色。如图5。图5分化第4dRA序贯诱导组nestin表达情况(x200)对三组诱导分化第10d的细胞爬片进行免疫细胞化学染色，诱导分化后的神经样细胞表达神经元特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)和星形胶质细胞表面标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。如图6一7。分化第1od各组NSE表达情况(x20())A:对照组B:4一/4十诱导组C:RA序贯诱导组图7分化第1od各组GF朋表达情况(x200)A::对照组B:4一/4+诱导组C:RA序贯诱导组 鲤丛全塑崛些丝学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎+细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响在倒置显微镜下(x100)随机计数10个视野的阳性细胞数(DAB显色，胞浆和轴突棕黄色为阳性细胞)，计算阳性细胞百分率，复片5次。在对照组细胞分化过程中可检测到少数NSE和GFAP表达的细胞，阳性率分别为11.8%土1.8%和19.0%土2.9%。采用4一/4+诱导法后，该组细胞的NSE和GFAP阳性细胞数明显增多，阳性细胞率分别为50.6%土2.7%和36.0%土2.5%，较对照组显著升高(尸<0.01)。采用RA序贯诱导法后，该组细胞的NSE和GFAP阳性细胞率分别为57.6%士1.4%和33.0%士2.0%，较对照组显著升高(尸<0.01)，但与4一/4+诱导组无显著性差别(尸>0.05)。统计结果见表1。表1各组细胞分化10d后NSE和GFAP阳性率的比较(%，见士S，n=10)组别NSE阳性细胞率GFAP阳性细胞率对照组.11.8士1.819.0士2.94一/4+诱导组▲50.6土2.736.0士2.5RA序贯诱导组57.6士1.433.0土2.0单因素方差分析各组阳性细胞率:对照组与今2礴+诱导组、R^序贯诱导组相比，P’<0.01.今闷+诱导组与RA序贯诱导组相比，尸‘>0.056.4.IN和4.IB蛋白免疫印迹检测结果提取纯化后ESCs和分化后第10dRA序贯诱导组细胞蛋白做蛋白免疫印迹，结果如图8。在4.IN条带中，分化后组比分化前组浓度高:在4.IB条带中，分化后组也比分化前组浓度高;提示4.IN和4.IB的表达量在分化后都增加。统计结果见表2一3。135kDa八刀ti·4.IN103kDaAnti一IB43kDap.aetin图8分化前后4.IN和4.IB的W冶t。”一blot结果A:ESCsB:分化第10dRA序贯诱导组细胞 郑州大学2008届硕_l..学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎十细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响表2.ESCS定向分化过程中4.IN的表达(戈士S)组别‘N4.IN/叼ctin分化前0.920肚0.0134分化后1.740(挂0.0167配对，检脸分析两组蛋白与卜洲n比值有显著性差异，尸<0.01表IESC:定向分化过程中4.IB的表达(戈士S)组别4.IB乍aotin分化前0.820(挂0.0147分化后1.580(汪0.0161配对t检脸分析两组蛋白与卜喇n比值有显著性趁异，p<0.01讨论1.胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(mbryonicstetncells，Escs)是从早期囊胚的内细胞团(irmercenmass，ICM)分离出来的一种多能细胞系;它能在体外长期不断自我更新，并保持多向分化潜能，可以分化为内、中、外三胚层来源的几乎所有类型细胞。2005年，本实验室已成功分离小鼠ESCs，具有增殖和分化能力，·表达SSEA一1和Oot一4，具有APK活性。本实验就是在此基础上进行的。ESCs的体外培养、扩增的关键是要保持其未分化状态。常用的分化抑制物有3种:滋养层细胞、条件化培养基(CM)和分化抑制因子。其中白血病抑制因子(LIF)是最常见的分化抑制物，但价格昂贵，提高了实验成本。本实验采用滋养层细胞和CM双重作用，代替含UF的ESCs培养基。滋养层细胞是具有猫附能力的细胞在丝裂霉素或Y一射线照射后能产生多种生长因子的细胞层，可用作克隆细胞的附着底物。常使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，其能够产生抑制ESCs自主分化和促进ESCs增殖的因子，可有效地促进ESCs增殖并维持其未分化的二倍体状态和多能性。但使用滋养层细胞需要注意如下几个方面的问题:①优化MEF原代培养方法:由于接种ESCs和收集CM需要大量MEF，传统的消化培养法已经不能满足此需要。按每只孕鼠平均10个胚胎， 郑州大学2008届硕士学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响采用传统的消化培养法，可获得3瓶(100clnZ培养瓶)细胞，取培养第7dMEF，台盼蓝计数为105/ml;本实验采用组织块培养法，MEF会随时间延长，逐渐迁移出组织块，可高效的获得MEF，约50瓶(100cmZ培养瓶)细胞，取培养第7dMEF，台盼蓝计数为1护/m1。②MEF生命期有限，不能在体外长期传代，如时间过长，其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失，最好使用第2一代MEF，杂细胞较少，MEF生长和分泌各种因子的能力也较强。③为避免MEF的迅速增殖对ESCs产生竞争性抑制，采用MMC进行预处理，使MEF失去分裂能力，但仍能生存并为ESCs提供必需的因子，而且可以去除体外培养环境中的毒素和代谢抑制因子。若处理时间过短，MEF会随ESCs共培养和传代时，也同时增殖;时间过长，则细胞死亡。根据本实验室以往经验，处理时间为2.5h。在终止处理时，必须应反复清洗，以免残余的MMC影响ESCs的增殖。④高质量MEF应该是细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。无间隙的单层MEF保证了其与ESCs充分接触并达到最佳效果。接种后的MEF可保存7。14d，7d内使用最好。根据实验计划，需及时更换新的MEF，以保证ESCs的未分化状态和高质量的CM。CM是在处理后的MEF上，加入MEF培养基3d后收集而来的，内含抑制ESCs分化因子。ESCs生长代谢所需的营养必须充足，所以在使用前将血清浓度由MEF培养基的10%提高至15%，另外加入p一琉基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸钠，制成Escs培养基。其中卜琉基乙醇最重要，除对EsCs的分裂增殖有促进作用外，还可保护细胞内酶，还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ESCs的损害。在MEF和CM的双重作用下，可维持ESCs的未分化状态。由于ESCs生长迅速，所以在复苏前必须储存充足的100%融合MEF(约50个100clnZ瓶)和高质量CM(至少1000一1500ml)。复苏传至25代的ESCs。第Zd，ESCs进入对数生长期，生长速度快，消耗的营养物质多，对酸性环境敏感，易坏死，所以当培养基颜色变为橘黄色时即半量换液，使ESCs所在的新环境更接近与原来的微环境。当长成多个集落后，密度达到70%即可传代。用胰酶/EDTA消化ESCs，需掌握好消化时间，以ESCs集落松动而MEF仍贴于瓶壁为最佳效果，轻柔吹打若干次，保证单细胞悬液。为了防止自发分化，传代密度需相对高(1:3一1:6)，保持细胞间的相互作用，促进细胞的分裂增殖。’ 郑州大学2(X)8届硕.卜学位论文RA序贯诱泞小鼠胚胎+细胞向神经细胞分化及对4.1蛋自表达的形响2.ESCs定向诱导分化为神经细胞进行ESCs分化前，必须将其与滋养层细胞分离。本实验根据差速贴壁法I’刀，利用ESCs与MEF贴壁时间的不同将两者分离。2.5一3h时，约90%MEF已贴壁，而ESCs几乎没有开始贴壁。延长收集时间至4h，会损失一部分ESCs，但保证了纯化效果，将MEF对分化的影响减到最小。常规消化ESCs时，将细胞悬液按1:2分入培养瓶中，间接增加细胞间距离，防止细胞叠加而过早贴壁。EsCs诱导分化为神经细胞的方法有很多，其中由Bainl41等于1995年创立的，’j又日诱导程序”，即4一/4+法是最经典的RA诱导法。让ESCs在去除抑制分化因子的培养液中悬浮培养形成EB，4d后再向培养液中添加全反式维甲酸(ATRA)，继续培养4d，然后撤去RA，补加培养基，观察神经细胞的形成情况。体外培养撤除LIF后，ESCs可能通过STAI，3信号途径进入发育通道I’8]，悬浮培养3d，可形成由外、中、内三个胚层结构组成的胚体;、随后，外胚层在外周中胚层的影响下发育成神经外胚层，最后分化为神经系统，这一过程与正常体内早期胚胎的发育很相似。4一/4+诱导法中，经过4d的EB悬浮培养，可形成球形三维立体结构，但尚未出现上述复杂的三胚层结构，不一定发生与体内胚胎发育相似的情况。而且在EB培养时，对营养和悬浮培养等条件要求很高，营养成分的欠缺或者EB悬浮不充分而提早贴壁，均会导致EB结构松散，活力降低，严重影响ESCs的进一步诱导分化[l，l。2000年，Lee【5]等改进4一/4+诱导法，使用“五步法”序贯诱导ESCs向神经细胞诱导分化，成为另一类常用的分化方法。整个过程大致为:扩增ESCs*解除ESCs分化抑制，形成EB*促进EB向神经前体细胞分化、使用神经细胞培养液，添加生长因子、神经营养因子，扩增神经前体细胞，利用促神经元存活因子诱导并维持神经元成熟。改良后的“五步法”没有使用RA诱导，而是模仿体内ESCs生长和分化环境，按照细胞生长阶段逐步改变培养基成分和血清浓度，添加各种生长因子，神经营养因子等，经历了由ESCs，EB，神经前体细胞*终末类型细胞，可能更接近于胚胎正常发育过程。这种方法的优点在于ESCs进一步分化为神经元或神经胶质细胞前，神经前体细胞已经得到了较高的纯化，有利于特定类型神经细胞的获得，但培养时间长，操作复杂，更主要的是需要添加多种生长因子和神经营养因子。这些因子的分化机制至今还不十分明确，对于何 郑州大学2008届硕士学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响阶段更换何种因子，文献报道不一，还需反复实践摸索，这就大大增加了实验成本。本实验吸取上述两种常用方法的优点，采用RA序贯诱导法进行ESCs向神经细胞的定向分化。整个分化过程有三个阶段:第一阶段，不形成EB，直接进行RA诱导。有研究证明，未经EB阶段培养，虽无法形成球形三维立体结构，但细胞之间仍可通过二维空间相互接触而产生联系[20l，所以本实验尝试跨过EB阶段，直接进行RA诱导。RA作为神经诱导剂，系维甲酸A的衍生物，是一类促神经生长因子，不仅对多潜能干细胞有诱导作用，对神经前体细胞也有促进增殖、成熟的作用。RA包括两种同分异构体:全反式RA和9一顺式RA。RA的细胞内信号转导可通过两类核受体:RARs(retinoieaeidree即tor)和RxRs(retinoidxree印tors)[2’一24]实现。RARs可被全反式RA或9一顺式RA激活;而RXRs仅能被9一顺式RA激活。两者可以形成同源二聚体，与细胞核内靶基因的反应元件RARE(RARresponseelelnent)和RXRE(RxRresPonseelement)结合，进一步激活靶基因转录。此外，RxRs还可以和RARs形成异源二聚体，而且这种异源性嵌合体与RARE结合能更加有效地激活靶基因转录。靶基因包括:早期反应基因(Hoxal、Hoxbl、Rexl)和晚期反应基因(eRABP11、队Rp、lamininpl、Coll峪ent冲eIV及组织纤溶酶原激活物)。目前RA诱导ESCs分化为神经细胞的机制仍未阐明。近年来大量研究提示RA诱导EsCs向神经细胞分化与ERK的激活高度相关12526]。samiaReffas[2刀的实验提示RA激活MAPK经典途径。配体受体结合后，依次激活接头蛋白一Ras一Ra卜MEK一ERK，再相应激活磷酷酶MKP一3和MKP一1进行区域化降解，从而保证ESCs的神经分化。此外，RA可能通过激活磷酸激酶C(PKC)的非经典途径激活ERK，启动相关基因的调控和表达[28一321。MEK抑制剂PD98059不能抑制RA诱导的神经分化效应，也不能减少ERK磷酸化激活，但PKC抑制剂GFIO9203X和PI3一K抑制剂能剂量依赖性地抑制RA诱导的ERK磷酸化及神经分化效应。PKC激活剂PMA是通过Ra刀ME玲ERK途径调控神经分化的。但这两条信号途径是如何进行相互调控目前还不清楚。 郑州大学2008屁硕_卜学位论文RA序贯诱异小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的华响将纯化的ESCs接种至明胶包被的直径3.scln培养皿时，注意掌握合适的接种密度。一般认为10勺ml的密度较为合适。密度太低，细胞间难以形成有效的连接，影响各种内外源信号的相互作用和发育基因的开闭，分化的神经样细胞明显减少:密度过高，4-5d后细胞生长空间会过于狭小，接触抑制作用增强，容易导致细胞分化停止死亡。从加入诱导培养基起，计为od。RA序贯诱导组分化48h后个别克隆外围可见散在的神经样细胞，提示RA诱导后部分ESCs可能直接分化为神经样细胞，跨过神经前体细胞阶段。第二阶段，初步筛选神经前体细胞，协助ESCs向神经细胞方向分化。仅仅采用RA诱导是不够的，ESCs克隆的外层可先分化为神经样细胞，而内层细胞仍保持为分化状态，分化不均一，得到的细胞种类复杂，不利于纯化。所以本实验在RA诱导48h后使用无血清神经干细胞培养基，并添加碱性成纤维生长因子(bFGF)，以减少非神经前体细胞。血清的成分很难确定，其中含有无特征的生长和分化因子，这些因素会干扰体外干细胞的培养向特殊细胞系发展，但无血清培养的问题在于细胞扩增的分裂指数很低，所以添加生长因子和某些神经细胞添加剂。bFGF是此分化阶段一个重要因素。它是由154个氨基酸组成的促细胞生长作用很强的多肤因子，广泛分布于成熟和未成熟的中枢神经系统的神经元、神经胶质细胞、成纤维细胞和内皮细胞等多种细胞中，是应用最广泛的刺激干细胞分裂的丝裂原信号，参与细胞生长发育和组织损伤的修复。众多的研究133·361表明bFGF具有很强的促进神经前体细胞增殖的作用。从胚胎发育过程来看，对bFGF反应的神经干细胞出现较早，对其增殖起作用，可较多的分化为神经元和部分胶质前体细胞【3刀。bFGF的生物活性是通过与靶细胞表达的特异性酪氨酸激酶跨膜受体结合，引起受体二聚体和酪氨酸自身磷酸化，并进一步引起脑内信号转导而产生的。也有研究发现细胞增殖或分化呈bFGF浓度依赖性[38]，认为低浓度bFGF启动分裂信号，而高浓度bFGF不仅启动分裂而且还能启动分化信号。还有研究[39]表明bFGF通过激活ERKI/2信号转导途径促进神经前体细胞胞核内DNA的合成，进而促进增殖。此分化阶段的细胞成分复杂，但培养基所含的bFGF仅对神经前体细胞具有促进分裂和增殖的作用，其他类细胞在该培养基中无法生长，因此此阶段大部分 郑州大学2008届硕士学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响非神经前体细胞会发生死亡，而神经前体细胞不仅可以存活，还可以分裂和增殖。NZ、B27是一种添加剂，有辅助增殖和分化的作用。1990年，Endalll等「40]的实验证实，神经干细胞的标志蛋白是巢蛋白(nestin)。nestin在神经胚形成时开始表达，随着神经细胞的迁移和分化的完成，nestin的表达量逐渐下降直至完全停止。目前，nestin常被用于神经干细胞的鉴定。本实验RA序贯诱导组分化后第4d，细胞数量明显增加，克隆团周围细胞开始逐渐伸出突起，但部分细胞仍聚集为克隆团块，这一时期的细胞形态多样，可见分化进程并非同步。免疫细胞化学显示无论是散在细胞还是聚集细胞，己部分分化为nestin阳性细胞。此时克隆中心开始有未分化细胞死亡脱落，开始出现大量细胞碎片，应特别注意与污染相鉴别，细胞碎片大小不一，无明显的游动现象，仅在局部移动，培养基容易变黄，但并不浑浊。此阶段细胞增殖旺盛应注意及时半量换液，保持原来的微环境，除去死亡细胞及碎片，保证贴壁细胞能正常吸取营养，并减少细胞死亡后释放的各种有害因子对分化细胞的不利影响。第三阶段，添加血清，撤除生长因子，促进神经前体细胞向神经细煦分化。无血清培养Zd(分化后第sd)以后，开始每天加入少量神经细胞培养基，目的在于保证原微环境的情况下，逐步降低bFGF浓度和增加血清浓度，第7d换为新鲜的神经细胞培养基，促进神经前体细胞向神经细胞分化。从整体来看，细胞形态相对一致，神经样细胞突起逐渐变细长，交织成网，未分化的细胞死亡脱落增加，神经样细胞多呈双极性，胞体圆亮，两极各有一细长突起，甚至比胞体长约5倍，亦可见细胞胞体呈多边型，有多个短突起，细胞形态一致，大部分为单一密集的神经样网络。免疫细胞化学证实，分化后的神经样细胞表达NSE和GFAP，两者的阳性率分别57.6%士1.4%和33.0%士2.0%。将上述RA序贯诱导法的过程总结如下:见图9。 郑州大学2008届硕卜学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎十细胞向神经细胞分化及对4.1蛋自表达的形响肥赫瞰一肥鞠胞神经样细胞(神经元和神经Eses二二、其他类型细胞(平滑肌细胞、纤维细胞等)胶质细胞)、一一?一一一护、一一一一.一一一、尸.一一一一口尹、一丫一岁RA(l0石moliL)无血清含bFGF加入少量含无因子含血清‘诱导48h培养基血清培养基培养基od一第3d一第sd一第7d一第10d图9RA序贯诱廿法分化过程本实验中采用经典的4一/4+诱导法作为阳性对照，首先悬浮培养4d，再加入RA诱导4d。其关键步骤是EB的悬浮培养。要注意两个问题:一是培养基的成分。EsCs进入细胞发育的阶段后，对营养的需求随之增加。p一琉基乙醇可与培养基中的半肤氨酸结合，使之易于进入胞浆，形成充足的谷肤甘肤，促进胚胎体的形成。本实验加入0.1mMp一筑基乙醇和200/0FBs，每24一36h半量换液;既防止营养缺乏而影响EB形成，又保证EB所处的新环境更接近于其原环境。二是维持EB的悬浮培养。悬浮培养时，细胞聚集为三维立体结构，利于细胞间相互作用和胚胎组织的分化，所以必须间隔摇晃。摇晃的时机有两个关键点，第一个在培养第ld，若此时细胞不贴壁，接下来2一3d也不易贴壁:第二个在培养第4d，由于EB的增大，容易贴壁，不再漂浮，此时更要注意多摇晃。第sd收集EB至明胶包被的培养瓶中，利于EB贴壁，随后梭形细胞从EB周围爬出。随着分化进行至第10d时，可见神经样细胞突起细长并形成网络，但从整体来看，该组神经样细胞出现的时间比RA序贯诱导组晚3d。对照组为自然分化组，撤除滋养层细胞和CM后，无法维持ESCs的未分化状态，ESCs自动进入发育通道。但不添加任何诱导剂，具有多向分化潜能的ESCs可分化为各种细胞，可能存在内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、神经细胞等。分化第10d可观察到仍有部分未分化ESCs，呈团状聚集，并绕以大量的圆形高亮的上皮样细胞，其周围可见少数梭形细胞。采用RA序贯诱导法获得的细胞虽然在形态上与真正的神经细胞相似，也能 鲤坚竺型些迹竺丝鱼立__RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的形响表达神经元特异性marker，但其是否具备神经细胞功能，还需要进一步研究，所以只能称之为神经样细胞。3.4.1蛋白在EsC。向神经细胞分化过程中的作用蛋白4.1家族是4.1基因超家族蛋白的一个亚类。从最初分离出4.IR后，到目前为止，该超家族成员至少有40个。基于其蛋白质氨基酸序列的相似性，这一超家族又被分为五个亚类:4.1蛋白、ERM蛋白、城in相关分子、PTPH(Pro城nt卿sinePhosphatases，酪氨酸磷酸酶)和NBL4(novelband4.1。like4)[4‘]。1976年，红细胞膜蛋白经三维十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳(sDs一队GE)后的第4.1条显色带[42]被命名为4.1蛋白。红细胞4.1蛋白也称为4.IR蛋白，是一种多功能的80kDa膜蛋白，能够稳定血影蛋白(s户瀚trin)和肌动蛋白(actin)的结合，连接细胞骨架和质膜，对于维持细胞形态和完整性非常重要。后来又陆续发现了几种与其具有很高同源性的蛋白质，存在与骨髓、小脑、肺、辜丸和胸腺等组织器官，根据4.1蛋白不同的组织分布、亚细胞定位和编码基因143书1，可分为4.IR、4.IN、4.10和4一B。见表4。表44.1蛋白分类及定位家族染色体定位组织分布亚细胞定位成员__4.1RIP33一32广泛表达，以造血组织中最为丰富.在脑内一些特定的神经群细胞膜，与血型箱蛋白体中表达如齿状回、小脑颖粒细胞C、P55结合4.1NZ如11.2网12脑表达为主，在心、肾、胎盘、胰脏也有表达突触:与PSD295与人M队受体亚单位共定4.1G6q23广泛表达，在脑中以胶质细胞为主胞浆与核周质，与FKBP13结合4.1B1sqll.32脑表达为主，在心、肾、胰脏也有表达;在脑中主要在缺乏4.IN分布于细胞·细胞接触表达的神经元中表达，如小脑浦肯野细胞以及丘脑4.1蛋白家族高度保守，具有相似的结构:氨基端FERM结构域、血影蛋白一肌动蛋白结合结构域(sABD)以及较为保守的狡基端结构域(CTD)。如图10。 郑州人学2008届硕_!:学位论文RA序贯诱份小鼠胚胎+细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的形响.队GpC翻NPss铆脚。州nN谬里梦嘎恶一娜琳咖砚心___土二蕊二启二___一、，CTD，FERM.PSsABO图104.!R蛋白的结构示愈图FERM:4.卜。的n一radixin一oesin结合结构域SABD:血协蛋白。肌动蛋白结合结构域CTD:狡基端结构域Bp^:带3蛋白C以:钙调蛋白GPC:血型糖蛋白Cp55:p55蛋自P:磷酸葵PIPZ:磷命酞肌醇二磷酸ps:磷命酞丝氨敌当前各国实验室小组对于4.1蛋白的研究集中在以下几个方面:4.1蛋白在各组织器官中的表达类型、选择性剪切形式和细胞内定位[I2·15，42确1;4.1蛋白在细胞一细胞和细胞一基质连接中的作用，如输精管上皮细胞、肾小管上皮细胞、神经细胞一胶质细胞、朗飞结结构等[47，48】;4.1蛋白与细胞内信使和酶的相互作用，如钙调蛋白、磷酸酶、PIPZ、p55等140】;4.IB蛋白的肿瘤抑制功能，如对前列腺癌、室管膜瘤的研究等150.51]。随着对4.1蛋白的研究深入，科学家们逐渐发现4.1蛋白在某些细胞分化的不同阶段表现出不同特点，如4.IR蛋白剪切产物随着红细胞发育成熟而发生改变t”’5.46，521;4.IB蛋白随着大鼠嗜铬神经瘤PC12细胞分化，由胞浆转移至核内[’31:4.IN蛋白在鼠小脑神经元发育过程中，随着浦肯野细胞树突生长以及贝格受神经胶质(Bergmanngha)对其包绕，由神经元转移至神经胶质细胞[’6】。在上述研究基础上，研究者普遍认为4.1蛋白对发育和分化可能具有重要作用。目前已有实验证明4.IB蛋白功能障碍会导致动物大脑发育异常，如{alpha}v{beta}8整联蛋白缺失鼠由于{alpha}v{beta}8一4.1蛋白连接障碍而出现血管和神经细胞之间失去联系支撑，诱发脑出血。值得注意的是，目前国内外对4.1蛋白在发育和分化中的作用研究未见系统报道，这一论点也需进一步的研究论证。由于神经细胞的分化伴随非常典型的形态改变并生长功能复杂的突起，我们推测神经细胞分化依赖于正常的细胞骨架功能，包括4.1蛋白。但胚胎干细胞分化过程中4.1蛋白的表达种类、剪切形式及细胞内定位的改变尚不清楚，这种变化对神经系统的分化发育会产生什么影响有待研究。考虑到4.INmRNA在脑内的含量是4.IB的2.4倍，4.IG的4倍以上1531，本实验的监测指标是4.IN和4.IB。 郑州人学2008届硕卜学位论文RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对4.1蛋白表达的影响通过蛋白免疫印迹方法观察到，未分化ESCs中已有4.1蛋白表达。在诱导分化生成神经细胞后，发现4.IN和4.IB表达量增加，提示4.1蛋白可能通过影响细胞骨架功能，进而对神经细胞的发育和分化起作用，从一条新途径来研究神经细胞发育，为ESCs分化机制乃至分化调控的研究提供一个新的思路。结论1.RA序贯诱导法可在ESCs分化第7d获得神经元样细胞，较4一/4+诱导法提前3d，且两者的NSE和GFAP阳性细胞率无差异，因此RA序贯诱导法可作为经典的4一/4+诱导法的替代方法。2.4.IN、4.IB蛋白的表达量随着ESCs分化为神经细胞而增加。 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郑州大学2008届硕卜学位论文胚胎十细胞体外分化的研究进展(综述)综述胚胎干细胞体外分化的研究进展姜媛媛综述邢莹审校1.什么是胚胎干细胞?1.1来源胚胎干细胞(embryoniostemcells，Escs)是由动物或人早期囊胚的内细胞团(ilmerCellmass，IcM)分离出来，经体外分化抑制培养筛选出的具有全能性的胚胎细胞。此外，还可用体细胞核移植技术制造出具有与供核体细胞基因组完全相同的ESCs。它能在体外长期不断自我更新，并保持多向分化潜能，可以分化为内、中、外三胚层的几乎所有类型细胞。还有其他几种原始的未分化细胞具有和ESCs部分相似的特性，比如来源于胚胎畸胎瘤组织的胚胎肿瘤细胞(。nb砂onieeareinomaeells，EC细胞)，也具有体外无限自我复制能力和分化潜能，但EC细胞子代细胞的染色体构型异常，是肿瘤细胞;来源于早期胎儿生殖峭部位的胚胎生殖细胞(embryonicgenncells，EG细胞)，虽然具有多潜能分化的个性，但自我复制很增殖能力很差，目前尚不能在体外长期增殖，且具有很强的随机分化的倾向。1981年，英国剑桥大学的Evans和Kau如an【’]等用不同的方法成功地从鼠的囊胚中分离出ICM，成功地建立了体外培养小鼠ESCs的方法。而人的ESCs系直到20世纪90年代末才得以成功。1998年，Thomson[2]等用患者捐献的受精卵在体外发育成囊胚，分离囊胚ICM，利用小鼠成纤维细胞作为培养ESCs的饲养层，建立了人的EsCs系。同年，sh田朴bolttl3]等用流产胎儿性腺成功地分离和培养并建立了人胚胎生殖细胞(embryonicgenncells，EGCs)系。有人将二者统称为EsCs系。1.2基本特性ESCs这一名词的概念一直没有一个特殊的标准，具有以下基本特性:(1)来源于内细胞团或囊胚的上胚层;(2)在抑制细胞分化因子(如LIF、STO细胞)存在的前提下，能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态(长期自我更新);(3)32 郑州大学2伪8届硕_卜学位论文胚胎十细胞体外分化的研究进展(综述)基因克隆，即一个单一的EsCs能产生一群具有相同遗传特性的细胞(克隆)，这些细胞有着与亲代细胞表现的基因表达、性状和功能完全相同(自我复制)，可实现ESCs在体外的“永生”:(4)ESCs能够分化成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)来源的所有细胞类型(多分化潜能);(5)显示并维持正常、完整(二倍体)并稳定的染色体核型;(6)在发育过程中能整合到所有胚胎组织中(体外经长期培养的小鼠ESCs，被植入另一胚胎形成嵌合体动物后，仍能产生所有组织;(7)具有能克隆形成胚胎细胞系的能力，并能产生卵子或精子细胞;(8)表达转录因子Oot一，后者继而激活或抑制大量的靶基因，以维持ESCs未分化状态;(9)可被诱导而继续增殖或进入分化状态;00)缺乏细胞周期中的G，期的限制点。ESCs大部分时间都处于细胞周期的5期，在此期进行DNA合成。与己分化的体细胞不同，ESCs不需任何外界刺激来启动DNA的复制。其中(1)(2)(3)(6)(7)不适用于人的EGCs，(6)和(7)不适用于人的ESCs，所有的特性都适用于小鼠ESCs。1.3胚胎干细胞的鉴定一株合格的ESCs系能够在体外进行无限制的对成分裂，进行非分化增殖或永久性自我复制，并维持稳定的二倍体的潜能，即可以分化成不同胚层的各种功能细胞。在分析鉴定ESCs表面标记物的研究中，人们发现未分化的ESCs表达与未分化状态相关的表面抗原，如胚胎阶段特异性抗原(SSEA)、碱性磷酸酶(APK)，其中鼠ESCs以SEEA一l为主;人ESCs表达则以SSEA一3和SSEA一为主，ssE^碑呈强阳性。Eses表面还表达转录因子oet一4、Nanog和soxZ，它们随着EsCs的分化表达下降。一般认为，这些分子只在ESCs中表达，对于维持ESCs的自我复制和多分化潜能具有重要功能。但近来发现，上述某些分子，比如SoxZ和Oot一4在成体干细胞中也有表达。比较ESCs和体细胞的差异表达基因，发现ESCs高度表达端粒酶，而体细胞端粒酶的表达量非常低，其在细胞增殖分裂时对染色体的稳定性有重要作用。除了分子表型特征，EsCs鉴定的另一重要方面是证实其多分化潜能。目前确定的方法有三种:(1)将ESCs移植到雌性假孕鼠的子宫内可以形成“嵌合体”;(2)将ESCs注入同种或免疫缺陷性小鼠的皮下、辜丸或肾包囊，宿主动物体内可形成畸胎瘤，具有从胚胎三个不同胚层来源的各种细胞类型:(3)将ESCs在体外进行随机自发的分化或诱导其向不同胚层的细胞分化，可形成类胚体(助b尽oid 郑州大学2008届硕士学位论文胚胎千细胞体外分化的研究进展(综述)body，EB)，在EB培养液中加入特定的分化诱导因子，可定向诱导Escs向特定方向分化。2.胚胎干细胞的体外分化胚胎干细胞理论上可以分化为体内任何一种细胞，体外大量繁殖可为细胞移植提供足够的来源，因此利用ESCs进行细胞移植的研究近年来已成为研究热点，对于临床应用和基础研究均具有十分重要的意义:一方面，要使ESCs成为临床上移植治疗的理想来源就必须经过体外分化来避免ESCs的成瘤性，并尽量得到高纯度的前体细胞;另一方面，研究ESCs分化过程中的分子机制，可以为研究人类胚胎发育早期定向和分化的机理提供线索。目前，EsCs的经典分化方法主要有两大类:一种是通过形成类胚体(EB)途径分化，将ESCs悬浮培养形成多细胞混合体的三维结构，即EB，来启动分化。EB的形成被认为是模拟了植入前的胚胎结构及分化环境，细胞之间形成相互诱导作用。另一种是直接诱导途径，即让ESCs在贴壁的培养环境中，通过向培养液中添加生长因子或其他种类的化学物质或将ESCs与其他种类的细胞共培养，使EsCs向某种特定类型的细胞分化。近年来己成功将ESCs在体外分化为各种细胞，现进行总结如下。2.1胚外组织的分化xu等【4刊将Escs在无血清的培养环境中加入骨形成蛋白一4(bonemorpho-geneticProtein4，BMP4)，能够诱导形成扁平的上皮样细胞，它们表达早期滋养层特异的基因，如MSxZ。加人BMP4后很快开始表达，并且呈上升趋势。随着BMP4处理时间的延长，一些成熟滋养层细胞标志，如绒毛膜促性腺激素也开始表达，并且在培养液中能够检测到分泌的绒毛膜促性腺激素，雌二醇及孕酮。Peral7.8〕等报道，在含血清培养体系中加入BMPZ等相关因子，发现ESCs也分化为扁平的上皮细胞，但是基因表达却是与胚外内胚层细胞相符。这些研究为探索胚外组织发育的分子调控提供重要的信息。2.2外胚层的分化2.2.1神经系统的分化神经系统的分化是ESCs分化研究中做的最多的.Reubino行等[91分离得到的神经前体细胞可以神经球的方式悬浮培养达25d。这些细胞表达早期神经外胚层的 郑州大学2加8届硕_!:学位论文胚胎十细胞体外分化的研究进展(综述)基因，如nestin、NCAM、musashi和Pax6，并且能够分化为神经元、星形胶质细胞和少量的少突胶质细胞，移植到帕金森大鼠脑内可分化为多巴胺能神经元，并可存活12wll”l。zhang等【”·’2]报道了类似的分化结果。这些神经前体细胞分别移植到新生小鼠和帕金森大鼠的脑内可存活、迁移和分化。c抑enter等[’3]用电生理的方法证明ESCs体外分化的神经元能够对神经递质做出反应。Schuldiner等【’4]用维甲酸(RA)，c帅enter等l”]用神经生长因子，schulZ等[’6]用能够诱导小鼠Escs分化为外胚层的条件培养液，也分别得到了较高的神经细胞分化率。Pera等[7.8】在用BMP诱导Escs分化为胚外内胚层时发现，如果用Noggin(一种BMP的类似物)阻断BMP信号途径，ESCs会分化成一种过渡状态的细胞，虽然不表达神经标志，但是如果转人含FGFZ的培养液中会很容易地转变为神经前体细胞。NO幼n这种诱导效果与它在胚胎的神经发育中起的重要作用的是一致的。2.2.2角质细胞的分化G~等l’7·!81用Escs分化为角质细胞，先经过EB途径分化，然后贴壁单层培养。分化的细胞先表达转录因子P63，二种皮肤及其衍生物发育中需要的转录因子，然后表达角质细胞的成熟标志，如cytokeratinl4及basonuclin。2.3中胚层的分化2.3.1心肌细胞的分化Kehat等[’9一211从hESCs的EB分化衍生物中分离出跳动的心肌，通过超微结构及电生理特点证明这些细胞具有胚胎或新生儿的心肌细胞的特点。Xu等122.23]通过自发分化形成EB来研究心肌的分化。在他们的实验中，70%EB里能观察到跳动的心肌。这些细胞表达心肌特异性的标志，包括心肌原蛋白1和a一肌球蛋白重链以及转录因子Nkx2.5、GATA一和MEF一2。此外，He等124】用电生理的方法显示由hESCs可以分化为多种心肌细胞类型，表现为人胚胎心肌细胞的功能特征。Snir等125]则用超微结构显示这些心肌细胞的成熟度。M~ery等t26]用共培养的方法诱导心肌形成，他们把ESCs与END一2鼠细胞系共培养，后者可以诱导小鼠ESCs和EC细胞形成心肌细胞。结果分化成两种细胞:一种是心脏内胚层细胞，另一种是不成熟的心肌细胞。它们肌纤维的排列方式、心房利钠素的表达及运动能力与胚胎心室肌细胞相似。Kehat等:27〕将hEscs移植到心肌梗死大鼠模型的心脏内可分化为心肌细胞可存活、增殖并与宿主心肌组织形成缝隙连接，为hESCs分化 郑州大学2008届硕卜学位论文胚胎干细胞体外分化的研究进展(综述)心肌细胞治疗心脏疾病奠定了基础。2.3.2造血细胞的分化Kaufinan等[2829]将hEscs与骨髓基质细胞系或卵黄囊来源的细胞系在含血清的条件下共培养，以CD34作为检测指标观察血系细胞的分化。结果发现CD34阳性细胞在第17d达高峰，占总细胞数的1%一2%，随后数目下降，这种前体细胞能够在琼脂上形成红系、髓系及巨核细胞系克隆。其中红系克隆表达成人及胎儿的血红蛋白，不表达胚胎血红蛋白。随后又发现Wnt信号参与了hESCs向早期造血前体细胞的分化过程[30l。chadwick等[3’】用EB的途径来诱导造血细胞。诱导体系中同时加用各种细胞因子。其中，BMP4与细胞因子sCF、FLT3配体、IL3、IL6及粒细胞集落刺激因子联合使用，使CD34+CD45+的细胞得率提高了6倍。cD34+CD45+这种表型与从胎儿腹主动脉分离得到的造血前体细胞表型一致。这些分化得到的前体细胞能够在琼脂上形成红系和髓系集落，并且可以通过添加BMP4使集落形成单位的产率提高。2.3.3内皮细胞的分化Levenberg等[32.33]在EB形成后第13一1sd，可以检测到CD31和vE一cadherin阳性细胞。同时，CD34与GATAZ的表达也呈上升趋势，这与早期内皮细胞的分化模式吻合。他们以CD31为标志，用流式细胞仪将阳性细胞分离得到纯化的内皮前体细胞，这些细胞继续培养能够分化为表达vonWillebrand因子的成熟内皮细胞，并且能够摄取低密度脂蛋白，而且在体外能够形成管样结构，借助人工基质形成的支架移植到动物体内后可以形成有功能的微血管。Yamashita等t34·36]通过实验认为由ESCs分化来的FLKI阳性细胞可作为血管前体细胞。他们将未分化ESCs在事先铺好胶原W的培养皿中培养4d，并添加10%胎牛血清来诱导Flk一1+细胞。也通过用流式细胞仪将阳性细胞分离。此时细胞并不表达其它内皮细胞和周细胞的标志物。将Flk一1阳性细胞继续培养，使用VEGF可明显诱导细胞向内皮方向分化，而使用PDGF一BB则可诱导大量外周细胞分化。这两类细胞在标志物的表达方式和功能上均与体内细胞相似。在体外这两类细胞可形成三维血管结构。将Flk一1阳性细胞注射入鸡胚可以整合并分化成内皮细胞和周细胞，而且可以形成大量网络样的血管结构。在机体正常发育过程中内皮系统和造血系统的形成有密切的联系。choi等[37一301通过形成EB，添加vEGF，可以在半固体培养基上形成集 郑州大学2008届硕_卜学位论文胚胎+细胞体外分化的研究进展(综述)落。转移到液体培养基继续培养并添加适当的细胞因子可以分化成内皮细胞和造血细胞，前者贴壁生长，后者则悬浮生长。他怕认为这种集落形成细胞就代表了内皮细胞和造血细胞共同的前体细胞。Nishikawa等【40，4’项d通过直接诱导ESCs，进一步提出Flk一1+vE一cadherin+细胞是内皮系统和造血系统分化的分界点。2.4内胚层分化相对于外胚层而言，由hESCs分化为内胚层的研究要少得多，即使是对于小鼠ESCs，内胚层的分化也是比较困难的。主要是因为人们对内胚层定向和分化的知识了解较少，这一系谱在早期分化时缺乏特异的标志，再加上胚体内胚层与胚外内胚层在基因表达方面有较多的重合，为内胚层发育的研究带来困难。2.4.1肝细胞的分化R田的bhatla等142]通过EB阶段或直接诱导贴壁的Escs，以丁酸钠诱导剂，将hEScs诱导为具有肝细胞标志的细胞。Baharvand等143】直接在无血清单层培养基上，用多种生长因子序贯诱导hESCs，获得细胞表现肝细胞的形态、超显微结构和一些肝细胞相关基因^FP，ALs，exls，eK19和eYPlsl。soto一oueierrez等[44]将mESCs与人肝脏非实质细胞(胆管上皮细胞、内皮细胞及肝星状细胞等)共培养，并添加FGF一2、人activin一A及肝细胞生长因子(HGF)，发现可诱导为表达肝特异性基因，分泌ALB，代谢氨类、利多卡因及安定的有功能的肝细胞。2.4.2胰岛细胞的分化Soria等[45】通过基因调控方法诱导mESCs分化为胰岛素分泌细胞。在诱导分化过程中，肝细胞生长素、胰岛增殖相关蛋白、‘尼克酞氨、葡萄糖和胰岛素样生长因子等均发挥了重要作用。L切rnelsky等1461发现在胚胎形成过程中，胰腺由紧邻脊索的内胚层单层细胞发育而来，与中枢神经的发育机制相似，于是采用“五步法”将ESCs诱导分化为胰岛素分泌细胞。Shi等[47]改进五步法，用“三步法”将Escs诱导分化为胰腺p细胞，表达多种相同的组织标记。3.胚胎干细胞定向分化为神经细胞神经系统一直被认为再生能力有限，尤其是成体神经元不再分裂，这大大影响了神经系统疾病患者的康复，因此体外诱导ESCs产生神经细胞，以治疗神经系统疾病的研究更加有意义。现将国内外学者对体外诱导ESCs分化为神经细胞的实验方法的探索做一简述。 鲤坚主塑绝竺进色丝石一一一一一一胚牲鲤塑塑创巡哩型鱼燮塑3.1维甲酸(retinoieaeid，RA)诱导法RA已被证实是一类促神经生长因子，不仅对多潜能干细胞有神经诱导作用，对分化末期的神经前体细胞也有促进增殖、成熟的作用。最初把RA作为诱导剂的是JonesI48]，在培养液中添加RA用于胚胎癌细胞P19向神经元和神经胶质细胞的诱导分化。24一48h后胚胎癌细胞集落边缘有神经样细胞爬出，免疫荧光法证明这些细胞具有神经元和神经胶质细胞的特性，并厕出诱导组乙酞胆碱醋酶的活性上升。1995年，由Bain等[49]创立的“八日诱导程序”，即4一/4+法是最经典的RA诱导法。即让ESCs在去除抑制分化因子的培养液中悬浮培养形成EB，4d后再向培养液中添加sx1o一7的全反式维甲酸，继续再悬浮培养4d，然后撤去RA，补加培养基，观察神经细胞的形成情况。免疫组化法检测这些神经样细胞能表达111型p一微管蛋白和神经微丝M亚单位，与神经细胞功能密切相关的蛋白基因包括神经微丝L亚单位(NF)、递质受体亚单位(GluRs)、转录因子Bm一3、神经递质合成酶(GAD67和GAD65)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。电生理显示了分化的细胞具有与神经递质功能性受体有关的电压控制的Na+、K+c扩十的离子通道。Fraichard等[50J发现EB中还表达神经细胞和神经胶质细胞的共同前体细胞的专一性标志一巢蛋白(nestin)，是大鼠胚胎神经管前体细胞的特殊抗原。在RA诱导ESCs的3一4d时，可以观察到一些具有折光性细胞，对nestin的抗体有明显的染色反应，这些细胞可能就是胶质细胞的前体细胞。随后这些细胞的胞浆逐渐长出，初步具有了神经细胞的形态。许多折光细胞RA诱导下源自ESCs的含有中间丝巢蛋白的神经上皮细胞可以分化为神经元(MA卫一2阳性)、星形胶质细胞(GFAP阳性)。随培养时间的延长，神经细胞类型的比例在不断变化。神经元和胶质细胞的前体细胞在分化的第3d出现，但数量很快下降，在10d后就检测不到。少突胶质细胞(O4阳性)和星状胶质细胞(GF妙阳性)初次出现在第sd;gd后，04阳性和GFAP阳性细胞数量都下降;ZOd时，两类细胞无法再检测到。有丝分裂后的神经元(MAPZ微管结合蛋白阳性细胞)初次发现是在第sd，在第gd大约25%的神经细胞呈MAPZ抗原阳性，MAPZ抗原阳性细胞一直增殖到第15d，随后数量下降，在20d时90%的神经样细胞是M人PZ抗原阳性。因为那时神经胶质细胞已经无法查到，可能是此时的培养条件适合于神经元的生长而不适合神经 郑州人学2008届硕_l:学位论文胚胎十细胞体外分化的研究进展(综述)胶质细胞的生长。3.2五步法Lee等15’·53]改进4一/4+法，使用“五步法”诱导Escs向神经细胞诱导分化:第一步在滋养层细胞上扩增未分化ESCs;第二步去除促有丝分裂素或分化抑制剂，ES细胞开始分化，悬浮生长，逐渐形成EB;第三步筛选nestin阳性细胞(即神经前体细胞);第四步使用神经细胞培养液，添加生长因子、神经营养因子，扩增神经前体细胞;第五步利用促神经元存活因子诱导并维持神经元成熟。总结为:解除ESCs分化抑制，形成EB*促进EB向神经前体细胞分化*神经前体细胞的扩增*进一步向终末类型细胞诱导分化。可以看出，该方法模仿体内胚胎干细胞生长、分化环境，按细胞生长阶段逐步改变培养液成分、血清浓度，添加生长因子，神经营养因子等，使ESCs经历了ESCs一EB一神经前体细胞一终末类型细胞4个过程，可能更接近于胚胎正常发育过程。该方法可获得大量神经前体细胞，具有分化为神经细胞的能力和突触前多巴胺神经元的功能。移植入帕金森大鼠模型脑内后，这些前体细胞可存活并整合入宿主的纹状体中，分化为多巴胺型神经细胞154】。Okalle等1551在ESCs集落形成类胚体后，采用胰岛素一转铁蛋白一硒一纤维连接蛋白(insulin.廿ansfe币n一sel耐uxn一fibronectin，ITSFn)培养法，其中85%的细胞被诱导成巢蛋白阳性细胞，即神经前体细胞，再添加碱性成纤维细胞因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGP)进行培养，这些前体细胞增殖了5倍，当撤走bFGF后，神经前体细胞分化为神经元和神经胶质细胞。c帅enter等113]在研究人Escs体外定向诱导分化时，首先在含有丝分裂原的培养液中让ESCs集落形成类胚体，再用PS一CAM和AZBS免疫选择或条件培养，使类胚体中神经前体细胞聚集增多，最终大约有60%一90%细胞进一步分化为成熟的神经元。zh助g等[lIl在形成类胚体后，将细胞在无饲养层、无血清、含有bFGF的神经细胞培养液中生长，观察到有大量神经管样的玫瑰花形结构产生，这些神经前体细胞可自我增殖，去除bFGF可进一步分化产生神经元(多为谷氨酸能神经元)、星形胶质细胞和少突胶质细胞。3.3基质细胞诱导法(astrom‘cell一d‘ved通耐ucingacti访ty，sn认)Kawasaki等[56〕认为由于拟胚体中含有三个胚层的细胞，不利于分析和研究神 郑州大学2008届硕_卜学位论文胚胎干细胞体外分化的研究进展(综述)经细胞分化的调节;并且诱导剂能干扰神经形成的模式和神经元的均一性，用SDIA法诱导mESCs向神经细胞分化，无需RA，也无需ESCs形成类胚体这一中间体，只用一种来自颅骨骨髓的基质细胞PA6与ESCs共同培养，再添加BMP4，在无血清的条件下，能有效地诱导ESCs向神经细胞分化，并获得高比例的酪氨酸轻化酶(t卿sinehydroxylase，TH)阳性多巴胺能神经元。此外，他们还进行了移植试验，把诱导的多巴胺能神经元移植到小鼠脑中，发现这些细胞能够很好地与小鼠纹状体整合，并仍然保持着TH阳性。这种结构尚不清楚的诱导物质暂被命名为“基质细胞来源的诱导活性(stromaleell一deriv记indueingactivity，50认)”。Mizuseki等肠7J在此基础上，他们对Escs向神经细胞分化过程中神经发育模式进行了深入研究，发现ESCs与基质细胞共同培养能诱导小鼠和灵长类ESCs向神经轴的背侧与腹侧的神经峭和神经板分化。利用定位标记法能检测到分化的细胞表达多种神经轴背腹神经标一记:HNF3旷(神经板标记)、Nkx2.2十(腹侧中枢神经标记)和TH冲币Pherin(多巴胺能中枢神经标一记)，但很少有细胞表达来自神经管背侧区域神经细胞标记。BMP4具有促进表皮发生和抑制神经分化的作用，但添加不同浓度的BMP4，仍能使ESCs向神经崎细胞谱系和背侧中枢神经分化。此外，将用sDIA法诱导过的细胞置于sHH(sonichedgehog)中，能促进这些细胞向腹侧中枢神经组织分化，并抑制向背侧组织发育。高浓度的SHH可有效地使神经板标记HNF3旷和腹侧中枢神经标记Nkx2.2十的表达量显著升高。‘Barberi等[58，59〕将小鼠骨髓来源的基质细胞Mss或517或主动脉一性腺‘中肾区来源的原始基质细胞作为饲养层细胞与ESCs在血清替代培养液中共同培养，得到神经前体细胞，再用不同的细胞因子序贯处理这些神经前体细胞，分别可以得到较高百分比的胆碱能神经元、5一经色胺能神经元、多巴胺能神经元、丫一氨基丁酸能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。将得到的多巴胺能神经元注射到6一OHDA诱导的帕金森模型动物的患侧纹状体内，sw后由中枢神经系统兴奋剂alnphetalnine或纹状体Dl、DZ受体激动剂apom。印址ne所诱导的旋转不稳定症状得到了显著改善，并且可以在注射细胞的纹状体内发现大量的酪氨酸轻化酶阳性细胞。Elbabetz等〔601使用同样的方法分离出神经管样的玫瑰花结构，这种新型结构具有多分化潜能，可能与SHH和Notch信号途径的激活有关。这些方法为神经元的诱导，尤其是用于治疗的某一种神经元的纯化提供了更 郑州大学2加8届硕_卜学位论文胚胎+细胞体外分化的研究进展(综述)有效的方法。3.4其他诱导方法3.4.1神经分化内定模式TropeP。等[6’，62]发现小鼠Escs在低密度、无血清、无饲养层细胞的条件下培养7d后，约0.2%的细胞可形成神经球，并进一步自发分化为神经细胞。证实体外培养的未分化ESCs在无外源性刺激因子的作用下也能自发分化为神经细胞。当去除神经抑制因子，包括细胞内各种抑制神经分化的信号转导和细胞间相互抑制作用，未分化ESCs就会自发向神经细胞分化。“神经分化内定模式”理论认为TGF一p超家族，包括TGF一p家族、BMP家族和活化素(activin)等信号分子有抑制神经分化的作用。在神经分化过程中，可检测到TGF、BMP等基因的表达下调163，641。3.4.2单层粘附培养诱导的神经细胞分化Pach.刀ik等[65]在不形成EB和不用RA处理的情况下，将小鼠Esc:生长在含有rrs的无血清DMENfF12培养液中，发现分化的细胞多数表达MAP一2等神经细胞的标志性蛋白。Ying等[66.67]人将细胞密度为0.5一1.5、1护/clnZ的小鼠Escs培养于0.1%明胶包被的组织培养皿上，以NZ、B27作为培养液，培养4d后，60%以上的细胞分化为神经前体细胞。该方法形成的神经前体细胞具有良好的可塑性，神经前体细胞在NZ、B27培养液中培养，得到的细胞多数为GABA能神经元;FGFS和SHH处理神经前体细胞可以得到较多的多巴胺能神经元。3.5基因修饰基因修饰己被应用于对哺乳动物ESCs的定向诱导，它是研究干细胞分化或增殖机理的重要手段之一，可以较高效率地得到特定的神经细胞。但是由于导入基因的功能多样性和不确定性，.较难判断该基因对细胞的整体和长远影响。SOX基因是脊椎动物在神经发育过程中表达的一个家族基因，SOxZ在早期的神经板和神经管广泛表达是早期的神经标志之一，在减少SOxZ信号的情况下，神经前体细胞无法变为成熟神经细胞。这说明SOxZ在CNS发育中起重要的作用，LIMin声f68]将geo基因与soxZ基因连接，用同源重组的方法整合到了EsCs内。当ESCs被RA诱导后，有50%细胞可以表达SOXZ蛋白，以18筛选可去除SOxZ阴性的非神经细胞。使绝大部分的成活细胞旱小的、卵形体的神经上皮样细胞。这 郑州大学2008届硕_t:学位论文胚胎十细胞体外分化的研究进展(综述)些细胞90%以上经免疫组化确定表达SOxZ、nestin。SOXZ筛选的前体细胞在48h至96h可以伸展出神经元细胞样的轴突。其神经元的标志物如MA卫2、tau蛋白及tubulin在48h后可以检测到。在%h时，90%以上的细胞表达神经元的标志物，包括神经丝的重链和synaPsinl。核受体相关因子一l(N叮1)是一种转录因子，直接结合于TH基因的启动子区域，调节维持中脑多巴胺能神经元表型的蛋白质的表达，如L一芳香族氨基酸脱梭酶(aromatieL一aminoaeiddee的oxylase，^DC)、囊泡单胺转运蛋白2(vesicularmonoaminetran印orterZ，VMATZ)和多巴胺转运蛋白(dopaminetransPorter，D心)，将全长的大鼠N二1中NA克隆到质粒中，稳定转染小鼠Escs。分化的细胞TH阳性率由5%提高到10%160，70]。bHLH是早期神经分化必需的一种转录因子，NeuroD、Mashl、01192均属于bHLH家族。Neur0D转染细胞在低密度培养条件下普遍向神经元分化。Neur0DZ、Mashl转染ESCs，可促进神经前体细胞形成.部分分化为多巴胺能神经元，Mashl作用强于NeuroDZ、OhgZ转染Escs后用RA诱导，多数分化为少突胶质细胞[7’，72]。目前多转染已知在神经发育过程中表达的特异性基因，所以对ESCs转染专一的转录因子、标志基因或有关细胞分化因子等遗传操作并结合报告基因和诱导条件选择是一条可能的探索ESCs定向诱导分化的途径。4.问题与展望胚胎干细胞可在体外“永生”，保持长期自我更新和多潜能分化，可作为人类神经发生研究和临床医学神经移植治疗的种子细胞，具有广阔的应用前景。目一前发展起来的ESCs向神经细胞分化的体外诱导法为阐明神经系统的发育和分化调控和临床应用提供了更多的可能。虽然这一领域的研究进展迅猛，但ESCs向神经细胞分化是一个非常复杂的过程，仍有许多鱼待解决的问题。比如，经RA诱导的神经细胞的效率很高，但诱导后的细胞不能再增殖，培养后5d内出现神经元死亡，是由于RA诱导ESCs向神经细胞或其前体细胞的信号机制尚不清楚;“五步法”的优点是，在得到神经元或胶质细胞前，神经前体细胞己得到较高的纯化，操作复杂且多次更换培养基，不利于该方法分化机制的阐明;SDIA诱导法和单层粘附培养的分化机制仍需进一步阐明:基因修饰对细胞的长期影响需要进一步观察和研究;无论用何种方法，如何提高神经细胞的分化效率，用何种方法来纯 郑州大学2的8届硕_卜学位论文胚胎+细胞体外分化的研究进展(综述)化已分化的细胞;如何减少体内外的诱导分化效率的差异。通过喃乳动物尤其是mESCs的神经诱导实验为hESCs的分化研究提供了大量经验，但hESCs与mESCs生长周期、体积大小、培养条件、诱导剂浓度和作用时间都不尽相同，特别是信号转导机制也不同，所有适用于mESCs的诱导方法都需要进一步验证，甚至更改。目前胚胎千细胞工程技术还处于初级阶段，迄今为止的研究结果还无法确定对ESCs施行哪一种干预手段对于基础研究和临床应用刁‘是最佳的，这些问题的回答有赖于更深入的研究。 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郑州大学2008届硕_卜学位论文中英文缩略词表中英文缩略词表缩写词英文全名中文全名APAnunoniumPersulPhate过硫酸按bFGFbasiefibroblastgrowth碱性成纤维生长因子CTDearboxyltenninaldomain梭基断结构CaMealmodulin钙调蛋白DMEMDulbeCeo，5ModifiedEssentialMediurn杜氏基本培养基EBEmbryonieBodies类胚体，拟胚体EDTAEthylenediaminetetraeeticaeid乙二胺四乙酸ESCsEmbryonieStemeells胚胎干细胞FBSfetalbovineserurn胎牛血清GFAP右lialFibrillaryAeidieProtein胶质原纤维酸性蛋白GPCGlycoPhorinC血型糖蛋白ICMInnerCellMass内细胞团LIFLeukemiaInhibitoryFactor白血病抑制因子MEFMouseEmbryonieFibroblast小鼠胚胎成纤维细胞NEAANon一EssentialAminoAeids非必需氨基酸NesinneuroePithelialstemeellProtein神经巢蛋白NSEneuronsPeeifieenolase神经元特异性烯醇化酶PBSPhosPhateBufl七redSaline磷酸盐缓冲液PIPZPhosPhatidylinositol4，5一bisPhosPhate磷酉旨酞肌醇二磷酸PKCProteinkinasee蛋白激酶CPSPhosPhatidylserine磷酷酞丝氨酸PTPHproteintyrosinePhosPhatases酪氨酸磷酸酶RAretinoieaCid维甲酸SABDsPeetrin一aetin一bindingdomain血影一肌动蛋白结合结构域SDSsodiumdodeeylsulfate十二烷基磺酸钠 郑州大学2008届硕_l:学位论文致谢致谢令本研究从课题设计、实施到最后撰写都是在导师邢莹教授的悉心关怀和精心指导下完成的。衷心感谢导师三年来在学习、科研和生活上给予我的关心、点拨、帮助和教导，并尽最大可能为我提供优秀的研究和学习条件，是论文得以顺利完成的重要保证。导师严谨的治学态度、渊博的学识和正直的为人使我收益良多，终身难忘。在此学习的每一天是我人生中有意义而难以忘怀的岁月，在今后的工作中，我将更加努力，不辜负导师的殷切期望。令衷心感谢郑州大学医学院生理教研室章茜老师、张朝老师、许继田老师、王志举老师、乔鹏老师、涂会引老师、张桂红老师、樊红混老师、刘素芳老师、李克老师以及其他老师在学习和教学上给予的无私帮助。特别感谢段萍老师对我学习屯生活的真诚帮助及在实验和论文方面的精心指导。令衷心感谢郑州大学医学院干细胞研究中心的都文海老师、韩雪飞老师、许燕老师和史玉洁博士给予实验上的技术指导及生活中的无私帮助。令衷心感谢郑州大学医学院干细胞研究中心及生理教研室的高胜利师兄、刘小转师姐、赵庆霞师姐、李佳师姐、李博师姐、申一疼同学、张秋莹同学、李欢娜同学、陈义兵同学、霍晓敏同学、翟彩红同学、翟溯澜同学、郭佳同学和周贺同学在学习、实验和生活上给予的关心和帮助，是这个积极进取、团结向上的集体给予我良好的学习和科研环境，使我得以圆满得完成了本论文的研究工作。令衷心感谢郑州大学研究生院各位领导和老师的培养及帮助。令衷心感谢参加我的论文评阅和论文答辩的各位专家教授。令衷心感谢我的家人和朋友对我的鼓励、理解和支持。令最后深深感谢所有帮助和关心我的老师、同学和亲人。