铜绿假单胞菌β内酰胺类药物耐药相关基因(18种)研究

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果铜绿假单胞菌β内酰胺类药物耐药相关基因(18种)研究作者：王伟陈瑛钱芳毛剑峰薛武进【摘要】目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中β内酰胺类药物耐药相关基因研究存在状况。方法自临床分离40株对铜绿假单胞菌，采用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因型(TEM、SHV、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)。结果40株中CARB阳性18株(

2、%)、35株oprD2基因缺失(%)，其余基因均阴性。结论临床分离的铜绿假单胞菌CARB基因携带率高。【关键词】铜绿假单胞菌；β内酰胺酶类；耐药基因全国细菌耐药性监测网所属57家三级甲等医院调查发现，XX年1月～12月，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)临床分离率为%，仅次于大肠埃希菌(%)列第二位［1］。近年来Pa菌耐药率不断增加，已经出现对第三代头孢菌素和亚胺培南耐受的Pa菌，给临床治疗课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义

3、的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果带来极大困难。研究发现，Pa菌产生各种β内酰胺酶(如TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CARB)、金属β内酰胺酶(如IMP、VIM、SPM、GIM)和质粒AmpC酶(如DHA、FOX、MOX)以及由于外膜孔蛋白D2(oprD2)缺失是对β内酰胺类药物耐药的主要机制［2～7］，但国内尚缺乏Pa菌β内酰胺类药物耐药相关基因全景式报道。为了解我院临床分离的Pa菌对β内酰胺类药物耐药机制，本文继对40株Pa氨基糖苷类修饰酶编码基因研究［8］之后，检测18种β内酰胺类药物耐药相关基因型(TEM、SH

4、V、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)，报告如下。1材料与方法0株Pa菌的来源、药敏试验及细菌处理均与文献［8］相同。基因检测采用PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各μmol/L，KCl10mmol/L，(NH4)2SO48mmol/L，MgCl22mmol/L，TrisHCl()10mmol/L，NP40%，BSA%(wt/vol)，TaqDNApol1U。总反应体积20μl(其中模板

5、液5μl)。热循环参数(PCR产物长度>500bp)PCR为：93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min，其余均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。结果课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经

6、济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果.1药物敏感性试验参见文献［8］。.2基因PCR检测0株Pa菌中CARB阳性18株(%)、oprD2基因缺失35株(%)，其余基因均为阴性。图1为balCARB基因PCR产物电泳图，balCARB基因扩增产物经测序和BLAST程序分析(/BLASTn)为CARB3型(与CARB3型基因序列［注册号DQ］高度同源，一致率100%)，Pa03号株balCARB基因序列与GenBank中balCARB序列同源性聚类分析(软件DNAMAN)见图2；图3为oprD2基因PCR产物电泳图。3讨论

7、1992年法国巴黎发现的TEM42是在Pa菌中第一个被报道的A类ESBLs［9］，最近国内报道在Pa菌中检出TEM、OXA、IMP、VIM、GES和DHAβ内酰胺酶等基因［10～15］。本组40株Pa菌中仅检测到CARB型基因和oprD2基因缺失。CARB型基因编码产生羧苄西林酶，为β内酰胺酶Bush分类中的2c，CARB型基因最早于1981年在Pa菌中发现［16］，近年又从不动表2与国内其它医院Pa菌β内酰胺类