铜绿假单胞菌β内酰胺类药物耐药相关基因(18种)研究论文

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1、铜绿假单胞菌β内酰胺类药物耐药相关基因(18种)研究论文王伟陈瑛钱芳毛剑峰薛武进【摘要】目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中β内酰胺类药物耐药相关基因研究存在状况。方法自临床分离40株对铜绿假单胞菌，采用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因型(TEM、SHV、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)。结果40株中CARB阳性18株(45.0%)、35株oprD2基因缺失(87.5%)，其余基因均阴性。结论临床分离的铜绿假

2、单胞菌CARB基因携带率高。【关键词】铜绿假单胞菌；β内酰胺酶类；耐药基因全国细菌耐药性监测网所属57家三级甲等医院调查发现，2002年1月～12月，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)临床分离率为10.3%，仅次于大肠埃希菌(14.2%)列第二位［1］。近年来Pa菌耐药率不断增加，已经出现对第三代头孢菌素和亚胺培南耐受的Pa菌.freelpC酶(如DHA、FOX、MOX)以及由于外膜孔蛋白D2(oprD2)缺失是对β内酰胺类药物耐药的主要机制［2～7］，但国内尚缺乏Pa菌β内酰胺类药物耐药相关基因全景式报道。

3、为了解我院临床分离的Pa菌对β内酰胺类药物耐药机制，本文继对40株Pa氨基糖苷类修饰酶编码基因研究［8］之后，检测18种β内酰胺类药物耐药相关基因型(TEM、SHV、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)，报告如下。1材料与方法40株Pa菌的来源、药敏试验及细菌处理均与文献［8］相同。基因检测采用PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmo

4、l/L，KCl10mmol/L，(NH4)2SO48mmol/L，MgCl22mmol/L，TrisHCl(pH9.0)10mmol/L，NP400.5%，BSA0.02%(in，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min，其余均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。2

5、结果2.1药物敏感性试验参见文献［8］。2.2基因PCR检测40株Pa菌中CARB阳性18株(45.0%)、oprD2基因缺失35株(87.5%)，其余基因均为阴性。图1为balCARB基因PCR产物电泳图，balCARB基因扩增产物经测序和BLAST程序分析(.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)为CARB3型(与CARB3型基因序列［注册号DQ359232］高度同源，一致率100%)，Pa03号株balCARB基因序列与GenBank中balCARB序列同源性聚类分析(软件DNAMAN)见图2；图3为oprD2基因PCR产物

6、电泳图。3讨论1992年法国巴黎发现的TEM42是在Pa菌中第一个被报道的A类ESBLs［9］，最近国内报道在Pa菌中检出TEM、OXA、IMP、VIM、GES和DHAβ内酰胺酶等基因［10～15］。本组40株Pa菌中仅检测到CARB型基因和oprD2基因缺失。CARB型基因编码产生羧苄西林酶，为β内酰胺酶Bush分类中的2c，CARB型基因最早于1981年在Pa菌中发现［16］，近年又从不动表2与国内其它医院Pa菌β内酰胺类药物耐药相关基因型检测结果比较［菌株阳性数杆菌、弧菌属、奇异变形菌中检出，已发现CARB19型9个亚型(.nc

7、bi.nlm.nih.gov/mucleotide/carb)。羧苄西林是第一个用于抗假单胞菌感染的半合成青霉素类药物，哌拉西林(第三代半合成青霉素类药物)抗菌谱广，抗假单胞菌活性比羧苄西林强数十倍，常用于治疗Pa菌感染，但哌拉西林对β内酰胺酶不稳定［16］。羧苄西林、哌拉西林的抗菌活性受CARB型基因编码产生的羧苄西林酶影响［17］。国内钱小毛等［18］报道在Pa菌中检出CARB型基因，阳性率为30.8%，但未对CARB型基因的亚型进一步分型。我们研究中40株Pa菌中CARB型阳性18株(45.0%)。Pa03号株CARB型基因PCR扩增产

8、物经测序和BLAST程序分析(.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)为CARB3型(与CARB3型基因序列［注册号：DQ359232］