琼脂糖凝胶电泳(1)

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1、DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA和protein最基本的定性定量方法。一般是琼脂糖胶或page胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA用丙烯酰胺凝胶。一、基本原理当把

2、一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη,γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到:v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒

3、在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。二、琼脂糖凝胶电泳通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是

4、采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格：琼脂糖凝胶/%m/V分离线性DNA片段的范围/kb0.350---600.61----200.70.8---100.90.5---7.01.20.4----6.0

5、1.50.3---3.0142.00.1---2.0琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液：缓冲液pH1.50mmol/LTris-NaH2PO4-1--5mmol/LEDTA7.5---8.02.50mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4-1--5mmol/LEDTA7.5---8.03.50mmol/LTris-乙酸-1--5mmol/LEDTA7.5---8.04.50mmol/L乙酸钠-乙酸-1--5mmol/LEDTA7.5---8.05.89mmol/LTris-H3BO3-1--5mmol/LEDTA8.3琼脂糖凝胶电泳常用的样品缓冲液(示踪染料

6、)：0.25%溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-30%甘油水溶液，并且这两种指示剂在琼脂糖凝胶中的迁移率不同，可以指示一定片段长度的DNA迁移率(具体见下表)。琼脂糖凝胶浓度溴酚蓝二甲苯青0.6%1kb/1.0%0.6kb2kb1.4%0.2kb1.6kb2.0%0.15kb/核酸分子量标准(Marker)：DNA电泳一定要用DNAMarker或者是已知大小的正对照DNA来估计片段的大小。应该选择在目标片段大小附近Ladder较密的Marker，这样对于目标片段大小的估计才比较准确。核酸电泳染色剂：核酸电泳以后，需要经过染色才能显现带型，最常用的染色剂是

7、溴化乙锭(EB)，其次是银染法。1、溴化乙锭(ethidiumbromide):一种荧光染料，可以嵌入核酸的双链碱基对之间，在紫外光线的激发下，发出红色荧光。2、银染法：染色液中的银离子可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使银离子还原成银颗粒，可以将核酸带染成黑色。灵敏度比EB高，但是DNA不易回收。琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶

8、液.2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将