琼脂糖凝胶电泳实验

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1、琼脂糖凝胶电泳实验2011-11-0309:43:56来源:生物秀评论:0我要评论实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】(1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理;(2)掌握使用水平式电泳仪的方法;(3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质,其等电点为pH2-2.5,在常规的…实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】(1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理;(2)掌握使用水平式电泳仪的方法;(3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工

2、程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质,其等电点为pH2-2.5,在常规的电泳缓冲液中(pH约8.5),核酸分子带负电荷,在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时,具有电荷效应和分子筛效应,但主要为分子筛效应。因此,核酸分子的迁移率由下列几种因素决定:(1)DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中移动,因而迁移得越慢。(2)DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同

3、分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的,超螺旋DNA移动得最快,而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。(3)电源电压。在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此

4、电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。(4)离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动;在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)(1)能插入DNA分子中形成复合物,在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光,而且荧光的强度正比于核酸的含量,如将已知浓度的标准样品作

5、电泳对照,就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑,所以现在也开发出了安全的染料,如Sybergreen。常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定;但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern杂交,因为变性后的RNA是单链,其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样,因而可以进行RNA分子大小的测定,而且染色后条带更为锐利,也更牢固结合于硝酸纤维素膜上,与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。【试剂与器材】(一)材料电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等(二)试剂1、50?TAE(1000m

6、L):242gTris,57.1mL冰醋酸,18.6gEDTA。2、EB溶液:100mL水中加入1g溴化乙啶,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,分装,室温避光保存。3、DNA加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,50%甘油(w/v)。4、RNA甲醛变性胶上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,1mMEDTA(PH8.0),50%甘油(w/v),用DEPC水配制,高压灭菌备用。5、5?甲醛变性胶电泳缓冲液:0.1mMOPS(PH7.0),40mM醋酸钠,5mMEDTA(PH8.0),用DEPC水配制,过滤除菌,室温避光保存。淡

7、黄色缓冲液可正常使用,深黄色应弃用。【操作方法】(一)常规的水平式琼脂糖电泳制备琼脂糖凝胶:按照被分离DNA分子的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量;一般情况下,可参考下表:琼脂糖的含量(%)分离线状DNA分子的有效范围(Kb)0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.11.制备琼脂糖凝胶:称取琼脂糖,加入1x电泳缓冲液,待水合数分钟后,置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液;加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。2.胶板的制备:将胶槽置

8、于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙,待胶溶液冷却至50℃左右时,加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不

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