琼脂糖凝胶电泳1.doc

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1、DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA和protein最基本的定性定量方法。一般是琼脂糖胶或page胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA用丙烯酰胺凝胶。一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电

2、场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη,γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到:v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗

3、粒半径和介质粘度成反比。带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。二、琼脂糖凝胶电泳通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量

4、的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格：琼脂糖凝胶/%m/V分离线性DNA片段的范围/kb0.350---600.61----200.70.8---100.90.5---7.01.20.4----6.01.50.3---3.02.00.1---2.0琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液：缓冲液pH1.50mmol/LTris-Na

5、H2PO4-1--5mmol/LEDTA7.5---8.02.50mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4-1--5mmol/LEDTA7.5---8.03.50mmol/LTris-乙酸-1--5mmol/LEDTA7.5---8.04.50mmol/L乙酸钠-乙酸-1--5mmol/LEDTA7.5---8.05.89mmol/LTris-H3BO3-1--5mmol/LEDTA8.3琼脂糖凝胶电泳常用的样品缓冲液(示踪染料)：0.25%溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-30%甘油水溶液，并且这两种指示剂在琼脂糖凝胶中的迁移率不同，可以指示一定片段长度的DNA迁移率(具体见下表

6、)。琼脂糖凝胶浓度溴酚蓝二甲苯青0.6%1kb/1.0%0.6kb2kb1.4%0.2kb1.6kb2.0%0.15kb/核酸分子量标准(Marker)：DNA电泳一定要用DNAMarker或者是已知大小的正对照DNA来估计片段的大小。应该选择在目标片段大小附近Ladder较密的Marker，这样对于目标片段大小的估计才比较准确。核酸电泳染色剂：核酸电泳以后，需要经过染色才能显现带型，最常用的染色剂是溴化乙锭(EB)，其次是银染法。1、溴化乙锭(ethidiumbromide):一种荧光染料，可以嵌入核酸的双链碱基对之间，在紫外光线的激发下，发出红色荧光。2、银染法：染色液中的银离

7、子可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使银离子还原成银颗粒，可以将核酸带染成黑色。灵敏度比EB高，但是DNA不易回收。琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃