肝炎病毒hbv hcv基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒senv的实验研究

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1、肝炎病毒(HBV、HCV)基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究中文摘要HBV和HCV是临床上最常见、危害最大的两种肝炎病毒，其长期持续的慢性感染与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关。随着人们对肝炎病毒认识的不断深入，尤其是肝炎病毒基因组学研究的进展，使临床上现有的血清免疫学方法和以单一PCR技术为主的检测方法其局限性越来越明显，由于不能真实、全面地反映患者体内病毒基因组的各种变异和动态变化，对患者个体的针对性诊断和治疗也受到很大限制。为及时将肝炎病毒的基因研究成果应用于临床实践，需要利用新的分子生物医学技术，研究和开发肝炎病毒的新型诊断方法和诊断试剂。

2、据此，我们重点研究了HBV和HCV基因诊断芯片的制备、应用，以及新型肝炎病毒SENV的实验研究。本文涉及的实验方法包括生物信息学分析(即芯片上探针和PCR引物的设计、测序序列的检索和比对)、探针和PCR弓l物的合成、PCR产物直接测序、基因芯片上探针的点样制备方法、血清中病毒的提取方法、PCR扩增和地高辛标记、分子杂交及显色、芯片杂交结果的数据处理等。芯片制备过程中的优化环节包括：尼龙膜型号和探针固定照射剂量的选择，探针3’末端加尾碱基数的确定，利用探针的互补寡核苷酸序列和部分PCR产物的测序验证芯片杂交的特异性，利用PCR扩增直接参入地高辛信号分子，分析其长度

3、、浓度及杂交时间对杂交信号的影响，比较了HBV标本的不同处理方法和不同PCR引物组合的扩增效率。经过二年多的反复实验研究，初步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV联检芯片的制备。在HBV基因芯片的研制过程中，先后制各了娜V050S、HBv-90S、HBV-120S、HBV-P／S区75S和HBV-C／X区25S等不同点阵数的基因芯片。最早的HBV-450S芯片包含的基因信息最丰富，理论上可检测I-IBV的7种基因型、4种血清亚型、4个P基因耐药相关的突变位点、2个S抗原突变位点、6个C区变异和X区的缺失突变，但部分探针特异性较差。在随后的改进中，H

4、BV-P／S区75S是目前临床实验研究较好的芯片，对基因型、血清亚型和拉米夫定耐药突变均能特异检测。同时，利用制备的HBV基因芯片，对45例纳入葛兰素威康公司评价新药拉米夫定疗效临床研究的乙肝患者、270例三中心医院的门诊慢性乙型肝炎患者和466例来自6个不同地区的乙型肝炎患者进行了拉米夫定耐药变异株和基因型的检测分析。HCV基因分型芯片的设计采用5’非编码区和相邻的核心区序列，5’非编码区的探针主要用于型的鉴别，而核心区的探针区分亚型，利用20个探针可一次性检出HCV的15个常见亚型。通过对76例HCV阳性血清的检测表明，1b型64例，2a型11例，3a型l例

5、，未见混合型感染和不能区分亚型的标本，6例不同基因型标本的测序结果也验证了芯片杂交结果的准确性。SENV是2000年末发现的一种新型肝炎病毒，目前对其各方面的认识还有待深入，致病性也存在争议。本文利用SENV的5’端非编码区和ORFl区设计两对套式PCR引物，检测SENV的感染状况。结果表明，两组引物除在新生儿中未检测到SENV感染外，而在我国不同地区、不同年龄和各种患病人群中均有较高的检出率，5’端非编码区引物的检出率(77．1％～89．2％)高于ORFl区引物的检出率(26．1％～50．0％)。进一步对两个区域38个PCR产物测序和分子系统进化树分析表明，P

6、CR扩增的产物不仅有SENV亚型序列，也包括TTV亚型序列，使用的引物越保守，越难以区分检测结果。总之，经过近三年的实验研究取得以下成果：①建立了具有独立自主知识产权的从微点阵制备到PCR标记、芯片杂交检测和软件分析的基因芯片操作平台。②自行设计了HBV基因分型和基因变异诊断芯片、HCV基因分型芯片和HBV、HCV联检芯片。初步临床应用结果表明，该芯片具有较好的准确性和特异性，与测序结果相比较，HBV芯片准确性达95．8％，HCV芯片准确性达98．3％。③实验研究表明，SENV可能与肝病不相关或条件致病，并且该病毒家族的基因型分类有待进一步的探讨。关键词：基因芯

7、片乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒聚合酶链反应SEN病毒2Preparedofhepatitisvirus(HBV,HCV)oligochipandexperimentalstudyofanewhepatitisvirusSENVAbstractHBVandHCVarethemostcommonandharmfulhepatitisviruses，thechronicinfectionofwhicharecloselyre]atedtothedevelopmentofcirrhosisandhepatoce]lularcarcinoma(HC0．Inourcountry

8、，HBVishighpr