抗丙型肝炎病毒第一高变区抗体捕获hcv病毒的实验研究

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1、抗丙型肝炎病毒第一高变区抗体捕获HCV病毒的实验研究【摘要】目的采用抗丙型肝炎病毒（HCV）第一高变区（HVR1）抗体，建立病毒捕获实验。方法重组表达HVR1嵌合抗原，免疫家兔，制备抗HVR1抗体，与20例患者阳性血清反应，通过HCVRT-PCR检测捕获结果。结果在30例样品中有13例完全捕获，16例部分捕获，仅1例未捕获。结论抗HVR1多抗可高交叉捕获HCV病毒。　　【关键词】肝炎病毒丙型；互补决定区抗体；聚合酶链反应　　Studiesontheantibodiesagainsthypervariable1(HVR1)ofhepatitisCv

2、irus(HCV)capturevirus　　　【Abstract】ObjectiveAsetoftestcapturevirusulated.Usingantibodiesagainsthypervariable1(HVR1)ofhepatitisCvirus(HCV).MethodsRebinantexpressionantigensofchimericHVR1,thepreparationofantibodiesagainstHVR1byimmuno-rabbit,entaritydeterminingregionsantibody;pol

3、ymerasechainreaction　　丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的世界性传染病。研究表明，约70％～85%的HCV感染将发展为慢性肝炎，其中部分最终将发展成为肝硬化和肝细胞癌，是极为严重的世界公共卫生问题。而目前仍没有有效的治疗和预防的方法，问题在于HCV变异大，而中和性表位所在的HVR1区变异更大，变异引起的免疫逃逸，要获得有效的免疫几乎不可能。但最近研究表明，HVR1虽然高变，但仍有一定规律性，存在着一定的免疫交叉反应性，又为这方面研究带来一线曙光。于是就出现了有关高交叉反应性HVR1的研究，也取得了可喜的结果。Zibe

4、rt［1］等证明HVR1-Ab能有效捕获同株病毒粒子，Zhou［2］等证明HVR1-Ab能阻止同株病毒吸附于培养细胞上。本研究用克隆表达的交叉性HVR1作为免疫原，制备抗HVR1抗体，对20份病人血清进行了体外捕获病毒实验，获得了满意的结果。　　1材料与方法　　1.1融合多片段HVR1抗原及抗HVR1体的制备［3］通过用生物信息学手段，从国内外已报道的123条HVR1序列，挑选了12条代表性HVR1序列，通过用酶联免疫对丙肝患者血清进行筛选，最终确定4条具有高交叉反应性的优势HVR1串联，克隆表达获得高交叉反应的HVR1抗原。将纯化的HVR1融合

5、蛋白，免疫雄性大耳白家兔，皮下注射1ml混合有完全弗氏佐剂1mgHVR1融合抗原，21、42天后用混合有不完全弗氏佐剂1mgHVR1再加强1次，51天后，耳静脉取血测效价，达到所需抗体效价要求后，颈总动脉取血。采用ELISA法对免疫动物血清的效价进行测试。　　1.2血清样品30例临床确认的丙型肝炎患者血清。　　1.3抗HVR1抗体捕获病毒试验　　1.3.1常规捕获病毒试验HCVRNA阳性血清用PBS1：50稀释，4℃离心16000r/min×15min。取上清50μl,加入免疫兔抗HVR1血清（1mg/ml）5μl，4℃孵育4h。加入50μl羊抗

6、兔IgG，4℃孵育1.5h,4℃离心2800r/min×15min取上清和沉淀分别做RNA检测。　　1.3.2样品经预处理后捕获病毒试验取HCVRNA阳性血清100μl,加样品预处理液50μl（0.3%TritonX-10030μl;1.5CHAPS0.15g;15%SDS1.5g;PBS10ml）;混合均匀，37℃,30min。其他试验步骤同常规处理方法。　　1.4HCVRNA的检测方法(所用试剂购于中国华美生物工程公司)　　1.4.1HCVRNA的提取取0.5ml离心管，加入HCV阳性血清50μl、裂解液400μl、样品处理液20μl,振荡混

7、匀，室温静置30min，期间数次振荡混匀。离心12000r/min×1min。弃上清，加70%的乙醇400μl,振荡混匀，离心12000r/min×1min。重复上述过程，用70℅的乙醇再洗一次。置56℃烤箱20min烤干。　　1.4.2逆转录将RT试剂根据待测样品按如下混合,DDH2O12.5μl，5×AMVbuffer6.0μl，25mmol/LMgCl24.8μl，10mmol/LdNTP3.0μl,1F1.5μl，1R1.5μl，RNasin0.3μl，AMV0.4μl，每管加RT反应液30μl,43℃45min,期间数次混匀之后,95℃

8、5min灭活,立即冰浴5min。离心8000r/min×2min，取上清5μl备用。　　1.4.3HCVPCR扩增1stPCR每管用量，