吲哚美辛逆转人肺癌a549ddp细胞耐药作用及机制的研究

《吲哚美辛逆转人肺癌a549ddp细胞耐药作用及机制的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中国医科大学博士学位论文吲哚美辛逆转人肺癌A549/DDP细胞耐药作用及机制的研究姓名：才久波申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：张彩霞201004·中文论著摘要·吲哚美辛逆转人肺癌A549／DDP细胞耐药的作用及机制的研究刖罱肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年增加的趋势，目前缺乏有效的治疗方法，如何改善肺癌的治疗状况、提高肺癌患者总的生存率是函待解决的重要问题。在肺癌的综合治疗中，化疗是最基本的治疗方法，也是不可缺少的重要手段。以顺铂等铂类药物为基础的联合化疗明显改善了晚期肺癌患者的治疗效果，成为肺癌治疗史上一座新的里程碑，但其毒副作用较大且易产生耐药性，严

2、重影响其化疗效果。P．印是mdrl基因编码的ABC家族的一种ATP结合膜蛋白，利用水解ATP释放的能量，逆浓度梯度将药物主动运输到细胞外，导致药物在细胞内蓄积减少而产生耐药。livin是一种新的抗凋亡基因，有学者发现livin是参与肺癌对放疗、化疗耐受的重要因素，在肺癌药物化疗后livin在肺癌组织中表达明显增强。非甾体抗炎药吲哚美辛(indometacin，In)是较强的前列腺素合成酶抑制剂之一，它具有一定抗肿瘤作用，近年来有些学者发现IN与化疗药物合用，能增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的毒性作用。本研究应用IN和DDP联合干预A549／DDP细胞，观察其对A549／DDP细胞增殖、

3、凋亡、P．印蛋白，Livin蛋白表达的影响，探讨其逆转A549／DDP细胞耐药的机制。材料与方法一、A549、A549／DDP细胞的培养A549和A549／DDP两株细胞培养在含10％新生小牛血清、含青链霉素各100u．mL"1的DMEM高糖培养液中，37"C，95％湿度，5％C02条件下培养，0．25％胰蛋白酶消化传代，每天换液一次，每2—3天传一次代。A549／DDP的培养基中加入3肛gmlo的顺铂以维持其耐药性。二、裸鼠A549／DDP移植瘤模型的制作当A549／DDP细胞进入对数生长期后，采用不含DDP的培养液继续传代两次后，消化、收集对数生长期细胞，细胞计数，调节细胞浓度

4、为7．8x106／ml。常规消毒裸鼠右前肢腋下皮肤，每只裸鼠皮下注射0．1ml细胞悬液，细胞数7x106，裸鼠接种后待肿瘤最长径达1．0cm左右，取28只裸鼠随机分为4组。实验分组为对照组，1．5mglN组、3．0mglN组、2．01ttgml’1DDP组。三、噻唑蓝比色法测定(MTT)用MTr法检测IN对A549及A549／DDP细胞作用24h、48h、72h的细胞毒作用，测定烈作用A549／DDP48h无细胞毒性浓度，测定A549／DDP对DDP耐药倍数；用顺铂分别处理A549、A549／DDP细胞48h，MTT法检测抑制效应，并求出A549／DDP对DDP耐药倍数；、MTT法

5、检测无细胞毒性浓度IN与顺铂联用对A549／DDP的抑制效应，求出IN对A549／DDP耐药逆转倍数。四、免疫细胞化学法细胞系经固定、封闭后，与Livin抗体孵育过夜。随后滴3JH--抗，DAB显色，苏木素轻度复染核。五、FCMAnnexinV／FITC、PI双染法对数生长期细胞，以1．25x105／mL密度接种于培养瓶中，24h后，分成4组，空白对照组、DDP组、玳组、IN+DDP组，干预48h后收集所有细胞，根据加meXinvFITC／PI试剂盒说明，流式细胞仪检测A549／DDP细胞凋亡。六、Hoechsot33258染色法检测IN+DDP诱导凋亡A549／DDP细胞IN+D

6、DP干预48h后固定，加入0．2mlHoechst33258染色液，荧光显微镜激发波长350nm发射波长460nm下检测凋亡细胞。七、JC．1线粒体跨膜电位检测将对数生长期的A549／DDP细胞，每孔2ml细胞悬液(5xlOJ个细胞)，分为3组DDP、IN+DDP、空白对照组处理细胞，继续培养，于48h收集细胞，取500ItLJC．1工作液将细胞沉淀均匀悬浮，用流式细胞仪分析。2八、caspase3活性检测将对数生长期的A549／DDP细胞，接种到6孔板中，每孔2ml细胞悬液(5×10J个细胞)，分为3组DDP、IN+DDP、空白对照组处理细胞，于48h收集细胞，裂解细胞，提取蛋白

7、加入检测试剂，用酶联反应仪测定A405波长。九、WesternBlot与RT-PCR应用WesternBlot与RT-PCR检测应用烈干预A549／DDP细胞后，检测mdrl、livin基因、P·gP蛋白、Livin蛋白的表达情况。十、SPECT、体外检测A549／DDP对99Tcm—MIBI摄取情况评价逆转效率A549／DDP细胞及裸鼠移植瘤在DDP联合应用IN的情况下，细胞及肿瘤组织对99Tcm-MIBI摄取率的改变情况，评价P-gp蛋白的功能。十一、统计分析各组