u-73122和粉防己碱对肝脏缺血再灌注损伤大鼠肝细胞钙池操纵的ca2通道的影响

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1、摘要摘要目的：建立并进一步完善适用于膜片钳(patchclamp)记录技术的Sprague—Dawley(SD)大鼠肝细胞的急性分离方法及肝脏缺血再灌注损伤(hepaticischemiareperfusioninjure，HIP,／)模型，利用膜片钳技术记录并研究生理及肝脏缺血再灌注损伤情况下SD大鼠肝细胞表面钙池操纵的Ca2+通道(store--operatedCa2十channel)的电流特性。观察HIRI后SOC电流(Isoc)的变化及磷脂酶抑制剂U．73122和中药成分粉防己碱(tetrandrine，Tet)对该变化的药物作用。方法：以SD大鼠为实

2、验动物，采用Ⅳ型胶原酶的原位两步灌注法分离并培养肝细胞；标准电极内液加入10mM的EGTA和21xM的thapsigargin激活SOC，在膜片钳全细胞模式下记录并研究肝细胞Isoc；以断流大鼠门静脉和肝动脉在肝脏中叶和左叶的分支30分钟后再恢复血流40分钟的方法，建立适用于膜片钳研究的大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，并分离肝细胞用以膜片钳记录实验；应用快速加药装置将不同浓度的药物U．73122(O．3pM、1pM、3pM、101_LM、30I-tM)和粉防己碱(3I．tM、100M、301aM、100pM、150I_tM)加至肝脏缺血再灌注损伤大鼠肝细胞周围，记

3、录Isoc，并观察药物影响。结果：进一步完善的SD大鼠肝细胞急性分离方法操作相对简单，用酶量少，获得的肝细胞产量平均达3．8×107／g肝脏，细胞纯度可达91％，细胞即时存活率为89．6％，适用于膜片钳记录实验。电极内液中加入10mM的EGTA和2pM的thapsigargin以利于激活SOC，利用膜片钳技术可以记录到明显的Isoc及钙依赖性的Cl‘电流，电流稳定在20分钟内无明显衰减。保持电位为0mV，给予．100mH80mv、持续时间200ms、阶跃为20mV的串联脉冲刺激，频率为0．5Hz，结果显示膜电位钳制于．100mV时，正常大鼠肝细胞Isoe的峰值

4、电流为．195．84：t=17．19pA(n=15)，生理状态下肝细胞Isoc的I．V曲线在负的膜电位表现为明显的内向整流性，钙依赖性的Cl‘电流在正的膜电位表现为外向整流性，反转电位接近于OmV。采用断流大鼠门静脉和肝动脉在肝脏中叶和左叶的分支30分钟后再恢复血液灌流40分钟的方法建立大鼠肝脏缺血再灌注模型，大鼠存活率高，获得的肝细胞与生理状态时相比存在明显形态学差异，肝细胞产量平均为3．0X10‘7／g肝脏，细胞纯度为85．3％，细胞即时存活率为78．2％；此方法摘要获得的肝细胞在后期的膜片钳记录实验中较易形成巨阻封接，易于破膜，适于进行膜片钳记录实验。在

5、相同的记录条件下，膜电位钳制于．100mV时，缺血再灌注损伤肝细胞Isoc的峰值电流为．447．31+26．04pA(n=15)，对照组肝细胞Isoc的峰值电流为．201．91+23．41pA(n=15)，两者存在明显统计学差异(n=15，P<0．01)；但是Isoc的I．V曲线特性和反转电位与生理组相比并无明显差别。观察不同药物对肝脏缺血再灌注损伤大鼠肝细胞IsoC的影响，发现各浓度U-73122(O．39M、19M、39M、109M、309M)和粉防己碱(3uM、109M、309M、1009M、1509M)对缺血再灌注损伤大鼠肝细胞的Isoc均有抑制作用，

6、39M的粉防己碱与对照组相比存在统计学差异(n=8，P<0．05)，其余各浓度药物组与对照组相比均存在明显统计学差异(n=8，P<0．01)；两种药物对缺血再灌注损伤大鼠肝细胞Isoc的抑制作用均呈浓度依赖性增强；IC50分别为4．07pM和40．209M。结论：本实验进一步建立并完善了适用于膜片钳记录技术的SD大鼠肝细胞的急性分离方法及肝脏缺血再灌注损伤模型。实验证实肝脏缺血再灌注损伤后大鼠肝细胞的Isoc幅值增大，表明SOC很可能对肝脏缺血再灌注损伤具有重要影响，通过SOC增加的Ca2+内流可能是引起肝脏缺血再灌注损伤中肝细胞钙超载的重要原因之一；药物U．

7、73122和粉防己碱均对肝细胞增加的Ca2+内流具有浓度依赖性的抑制作用，减轻了肝细胞内的钙超载，从而具有保护缺血再灌注损伤的肝细胞的功能。本次研究进一步探讨了SOC对HIRI造成的肝细胞钙超载的影响，并为寻找拮抗肝细胞钙超载的药物、解决外科临床的实际困难提供理论和实验依据。关键词：肝细胞，肝脏缺血再灌注损伤，膜片钳，钙池操纵的Ca2+通道，U．73122，粉防己碱。nAbstractABSTRACTobjectives：ThisexperimentistOimproveandfine—tunethemethodinisolatingSprague-Dawle

8、y(SD)rathepatocytes