weak通过erk12通路促进大鼠心肌成纤维细胞mmp2与ⅰ型胶原表达

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1、山东大学硕士学位论文CONTENTSChineseabstract．．IEnglishabstractIIISymbolicIllustration．VIAbbreviations．．1MaterialsandMethods9Results．．16Typicalcases．17Discussion．．19Conclusions．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23PhotographsandTables．．24References．．．．．．．．．．．．．．．．．32Review．3

2、4Acknowledgement．43Artical。44万方数据山东大学硕士学位论文TWEAK通过ERKl／2通路促进大鼠心肌成纤维细胞MMP2与I型胶原表达研究生：巨媛媛专业：内科学(心血管病)导师：隋树建中文摘要背景：随着经济的发展及生活水平的提高，心血管疾病的发病率在我国呈现逐步增长的趋势。有数据表明，心血管疾病是全球慢性病死亡的主要病因，其中，高血压与卒中和心肌梗死的发生密切相关。左心室肥厚作为高血压病的靶器官损害之一，是多种心血管疾病的独立危险因素，造成心律失常、心衰、猝死等不良预后。

3、在左心室肥厚由代偿转变为失代偿甚至心衰巾，心肌纤维化发挥着重要作用。心肌纤维化主要表现为间质中胶原的合成增加和分解减少，胶原含量及结构的细微改变即可影响心室的僵硬度，进而影响心室的舒张功能。心肌组织中的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)主要由心肌成纤维细胞分泌，介导心肌细胞外基质尤其是胶原的降解。MMPs的表达和活性增加，及与其抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)的比例失衡是造成心

4、肌纤维化的直接原因。有证据表明，MMP2通过降解胶原蛋白、降解细胞间连接、水解并激活调控因子等机制促进心肌纤维化过程。除了机械应力、神经体液调节外，炎症在心肌纤维化的进程中也起到重要作用。炎性因子TNF超家族成员除了发挥对肿瘤的杀伤作用及促炎反应外，也参与心肌纤维化的发生发展过程。肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(tumornecrosisfactor-likeweakinducerofapoptosis，TWEAK)是TNF超家族成员，在多种细胞、组织及器官中均有表达。在心血管系统中，TWEAK能通

5、过促进心肌细胞肥大、介导内皮细胞损伤、加速血管平滑肌细胞迁移、改变心肌细胞外基质成分等机制参与心肌梗死、扩张性心肌病、高血压等心血管疾病的发生发展过程。TWEAK万方数据山东大学硕士学位论文被报道能够促进心肌成纤维细胞增殖及胶原合成，该过程由P38通路介导。P38通路与ERKl／2(extracellularsignal—regulatedkinase1／2)通路、JNK(c-junn—terminalkinase)通路和ERK5通路同属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedpr

6、oteinkinase，MAPK)家族，广泛存在于真核细胞内。除P38通路外，ERKl／2通路被证实与心肌细胞肥大、心肌纤维化密切相关。因此，本研究旨在探索TWEAK能否通过ERKl／2通路调控心肌成纤维细胞(cardiacfibroblasts，CFs)I型胶原及MMP2的表达，进一步揭示TWEAK促进心肌纤维化的作用机制。目的：研究肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂调控大鼠心肌成纤维细胞表达基质金属蛋白酶2及I型胶原的作用机制。方法：1．胰酶消化法分离培养新生大鼠原代CFs，免疫荧光法鉴定CFs。2

7、．利用Westemblot法检测磷酸化ERKl／2(p．ERKl／2)的蛋白表达水平，从而确定重组人TWEAK(rhTWEAK)及ERKl／2通路抑制剂PD98059对CFs的最佳干预浓度及干预时间。3．采用real．timePCR以及Westernblot法检测干预后MMP2及I型胶原的mRNA与蛋白表达水平。4．采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同处理对细胞增殖的影响。结果：1．CFs呈梭形或不规则多角形，胞体较大，有折光性。胞浆透明，胞核呈卵圆形，无自发性搏动。波形蛋白免疫荧光显示，细胞抗

8、vimentin抗体表达为阳性。2．TWEAK及抑制剂PD98059对ERK蛋白的作用：1001ag／LTWEAK干预CFs显著上调P．ERKl／2的蛋白表达，并呈时间、剂量依赖性。PD98059阻断ERKl／2通路后能抑制P．ERKl／2蛋白的表达，并且PD98059浓度在51amol／L时达最大效应。3．TWEAK及抑制剂PD98059对MMP2mRNA与蛋白表达的调控：100}Lg／LTWEAK能显著上调MMP2mRNA与蛋白表达水平，5Irtmol／LPD98059阻断ER