i3kaktfoxo3a信号通路和pkacreb信号通路在氟西汀保护皮质酮诱导pc12细胞损伤中的作用

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1、硕士学位论文P13K／Ak／Fox03a信号通路与PKA／CREB信号通路在氟西汀保护皮质酮诱导PC12细胞损伤中的作用硕士研究生：曾冰清指导老师：徐江平摘要背景：抑郁症(depressive)是一种常见的慢性精神性疾病，主要表现为情绪低落、悲观、兴趣减退、缺乏主动性、思维迟缓、记忆减退等症状。临床研究发现，抑郁患者的下丘脑一垂体一肾上腺轴(hypothalamic-pituitary—adrenalaxis，HPAaxis)HPA轴比正常人更为活跃亢进，体内肾上腺糖皮质激素水平升高，而海马神经细胞又对肾上腺糖皮质激素高度敏感，导致神经细胞受到不同程度的损伤、甚至是死亡。因此保护神经细胞

2、不受到损伤，成为了抑郁症的治疗中不可忽视的一项。许多研究表明，抗抑郁药能通过改变相关蛋白的磷酸化状态和相关基因的表达水平，从而促进海马神经元细胞的增殖、成熟以及数目增加，表现出神经保护作用。这些研究成果，使研究学者们对抗抑郁药潜在的神经保护作用及其细胞分子机制倍加关注。P13K恼kt，Fox03a信号通路，是细胞内重要的信号转导通路之一，主要参与调节细胞的生长、分化、代谢、凋亡等过程，通过影响下游多种靶基因、靶蛋白的活化状态，促进细胞存活，抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用。在精神疾病中的作用已引起广泛重视。而PKA／CREB／BDNF信号通路，也早已被证明参与抑郁症的治疗及神经保护过程当中，

3、PKA激活CREB磷酸化，进一步激活其下游信号分子BDNF。BDNF与其受体TrkB结合，激活细胞内信号级联反应，促进神经发生、突触可塑性、神经元损伤后修复。万方数据摘要目的：由于PCI2细胞具有非常典型的神经元细胞的特征，而且高度表达肾上腺糖皮质激素受体，已广泛用于神经系统的研究当中。本课题以PCI2细胞为研究对象，利用抑郁症发生时HPA轴活化导致海马神经元损伤的特点，采用皮质酮诱导抑郁症的细胞模型，用经典的抗抑郁药氟西汀考察P13K／Akt／Fox03a是否参与这一疾病，研究在抑郁症发生过程中该信号通路的作用，并探讨该通路与P觥REB／BDNF信号通路的关系。方法：1、以PCI2细胞

4、为研究对象，建立由皮质酮诱导的损伤模型，观察氟西汀对细胞损伤模型的保护作用。首先，采用MTT法检测了不同浓度的皮质酮(0—1000“M)对PCI2细胞的损伤作用，根据不同浓度皮质酮对细胞造成的损伤程度，选择能够杀死60．70％细胞的皮质酮浓度用于后续实验。此外，还使用RU486(肾上腺糖皮质激素受体拮抗剂)，对抗皮质酮的损伤作用，由此判断皮质酮带来的细胞损伤是否由肾上腺糖皮质激素受体介导。接着，将细胞分为正常组、模型组、不同浓度的氟西汀(0．1脚～100pM)给药组，采用MTT法检测了氟西汀对皮质酮诱导PCI2细胞损伤是否具有保护作用，并确定了后续实验中氟西汀使用的浓度；采用Hoechs

5、t染色，在荧光显微镜下观察细胞形态，统计各组中细胞的凋亡数目，从而进一步探究氟西汀对皮质酮诱导PCI2细胞损伤是否具有保护作用。2、考察P13到Akt与PKA是否参与氟西汀对抗作用。采用通路阻断剂预处理(P13K的抑制剂LY294002，50gM，40min；Akt的抑制剂KRX．0401，45uM，40min；PKA的抑制剂H89，10lxM，40min)，观察皮质酮对PCI2细胞的损伤作用，以及氟西汀对细胞损伤模型的保护作用是否会被削弱，采用MTT法检测细胞存活率。3、考察氟西汀对Akt／Fox03a及CREB活化的影响，以及氟西汀影响Fox03a及CREB磷酸化的信号通路。首先，采

6、用不同浓度氟西汀(1rtM、3uM、10oars)分别处理细胞不同时II万方数据硕士学位论文间点(5min、10min、20min、40min)，通过WesternBlot检测Fox03a、Akt、CREB等蛋白磷酸化水平，以获得在基础条件下，氟西汀对这些蛋白表达及磷酸化影响的时效及量效关系，探究氟西汀如何影响Ak仃ox03a及CREB的活化。接着，采用通路阻断剂预处理(P13K的抑制剂LY294002，50／aM，40miraAkt的抑制剂KRX．0401，45／aM，40rain；PKA的抑制剂H89，10洲，40min)，通过WesternBlot检测Fox03a、Akt、CREB

7、等蛋白磷酸化水平。4、考察氟西汀在皮质酮存在的条件下，对Fox03a及CREB磷酸化的影响；以及氟西汀促进Fox03a及CREB磷酸化影响的信号通路。首先，将皮质酮(500pM)与氟西汀(1IxM、3／aM、10／aM)共同处理细胞20min，通过WesternBlot检测Fox03a、Akt、CREB等蛋白磷酸化水平，以获得在造模情形下，氟西汀对这些蛋白表达及磷酸化的影响。接着，采用通路阻断剂预处理(P13K的抑制剂LY29400