hlac克隆 表达及在母胎耐受作用的初探

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1、上海第二医科土学博士学位论文中文捕要HLA—C克隆、表达及在母胎耐受作用的初探博士研究生：李卫党导师：范丽安上海第二医科大学免疫学研究所中文摘要≮组成的具有高度多态性的遗传复合体，位于人类6号染色体的短臂上。分为HLA(humanleukocyteantigen)复合体，它是一个由一系列紧密连锁的基因座HLAI类、II类、III类3个基因区。HLAI类基因又分为经典I类基因(HLAIa)和非经典I类基因(HLAto)。HLA．C基因属于HLAIa，是最早发现的3个功能基因之一。HLAIb发现较晚，包括HLA．E、F、G

2、3个基因，目前在胚胎种植发育和肿瘤免疫中研究较多。HLA-C抗原虽已发现多年。但因其有限的多态性及在细胞表面的表达低于HLA．A、B分子，血清学分型困难。多年以来对其在免疫系统中的作用研究甚少。直到1990年Moretta及其同事在研究NK细胞杀伤作用时，直接证实HLA．C分子具有抑制NK细胞细胞毒作用。迸一步研究表明它是NK细胞表面的杀伤抑制性受体(killerintfibitoryreceptor，Km)的配体。因而出人意料地使HLA．C成为免疫系统中一个值得关注分子，并使NK细胞受体研究取得重要突破性进展。与此同

3、时，在研究母胎界面滋养层细胞分子表达时发现，它虽不表达经典的HLA-A、．B及全部的HLAII类分子，却表达经典的HLA-C和非经典的HLA．G、E分子。HLA．c分子这～特殊表达，提示它可能通过与子宫NK细胞之间的相互作用在维持母胎耐受中起重要作用。以往的大部分研究都是将HLA．C分子表达在B淋巴母细胞系LCL722．721上进行的。为了更能反映它在母胎界面的真实情况万本课题试图以滋养层细胞表达HLA-C为模型，对其功能进行研究。为此克隆了HLA．C基因，并将它表达在HLAI类分子阴性的JAR细胞上，从以下几方面初步

4、探讨了HLA．c分子的生物作用．第一部分HLA_cl目l棱细胞毫琏麓俸的相慧、薹定反表达为研究滋养层细胞表达HLA-C分予的生物学作用及它与NK细胞受体之间的相互作扇：龟们从一健康汉族个体的外周血单个细胞中直接克隆了HLA．cw+0602轴，构建pcDNA3-HLA-c真核表达载体，在HLAI类分子阴性-l-上海第二医科文学博士学位论文中文摘要—————————_、———_—————，———，——_——————————_————————————-———--——_-———_————————————一——的滋养层细胞来源的

5、绒癌细胞系JAR细胞表达。并获得了高表达HLA-C分子的JAR细胞(78％1。由于HLA-A、B基因和HLA．C在它们的cDNA两端高度同源，我们在扩增HLA．C基因时，发现HLA．A、B基因也可同时被扩增。为进一步研究NK细胞受体与HLAI类分子之间的相互作用，我们也克隆了}ⅡA-A’3001和HLA-B*27052基因。)第二部分HLA-C细胞表面表达对RSA庸人外月血Nl【细胞功艇的影响利用直接分离的外周血NK细胞对JAR细胞和表达HLA-C的JAR细胞进行细胞毒试验，结果直接分离的NK细胞对两者都无细胞毒作用X

6、为获取纯度相对较高的NK细胞，我们在体外用PHA、rlL-2扩增初步分离纯化的NK细胞，结果CD56+的NK细胞获得了不同程度的扩增(48，20～70．90％)，并表达不同程度的KIR2D受体f35．06％．63．38％)。正常人和RSA病人体外扩增的NK细胞对JAR细胞、JAR-HLA．Cw*0602细胞均有细胞毒活性。用EB6单抗阻断NK细胞抑制性受体，rlL-2活化的NK细胞仍对靶细胞有杀伤作用。与正常对照相比RSA病人NK细胞对靶细胞的细胞毒作用未见著性差异(P>o．05)。对正常人和RSA病人体外扩增的NK细

7、胞与靶细胞作用4小时和20小时时，收集细胞上清进行IFN-y的检测，结果显示表达HLA-C分子的JAR细胞与RSA病人NK细胞作用后，其NK细胞分泌的IFN-丫与同JAR细胞作用后分泌的IFN--／无明显差异。但两者在20小时时分泌的IFN-Y水平都明显高于4小时时分泌的量口

8、-C表述对HLA—E分子以及Nl【妇赡受俸毫选的影响用FACS分析HLA-E分子在细胞表面的表达，结果显示JAR细胞表面表达少量的HLAoE分子(11．18．16．32哆幻。而HLA-C转染的JAR细胞表面表达的HLA-E分子明显增高(35．72-43．44物，比未转染的JAR细胞袭达的HLA-E高出近2倍。一～弋、NK细胞与HL