KIR2DL4与母胎免疫耐受作用初探

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1、上海第=医科大学博士学位论文中文摘要KIR2DL4与母胎免疫耐受作用初探博士研究生：颜卫华导师：范丽安上海市免疫学研究所上海第二医科大学中文摘要母胎免疫耐受是人类乃至整个哺乳类动物得以繁衍生息的基础，妊娠相当于一次成功的同种移植过程，胎儿一半基因源于父亲，所编码的分子对母体来说是一种同种异体抗原，理应被母体免疫系统所识别并加以排斥，但正常情况下母体并不对胎儿产生排斥反应，其形成机制仍是一个谜。最初Billingham和Medawar提出胎儿抗原缺乏免疫原性、妊娠过程中母体免疫功能低下的假说逐渐被否定。事实上，胎儿抗原具有免疫

2、原性，母体外周血中针对父源性抗原的T、B淋巴细胞功能的抑制，提示妊娠过程可形成一种主动致耐状态。更重要的是，Erlebacher等通过动物模型体内实验，发现NK细胞决定了滋养层细胞的命运。Croy等则证明了子宫NK细胞产生的IFN—y对妊娠早期胎盘的发育、分化起重要作用。因此，子宫NK细胞细胞毒和细胞因子分泌活性的合理调节，是维持母胎免疫耐受的关键。胎儿绒毛外滋养层细胞表达特定的HLA抗原组合以及母体子宫蜕膜组织中淋巴细胞分布格局形成了妊娠早期母胎界面独特的组织学特点。胎儿绒毛外滋养层细胞不表达高度多态性的HLA—A、一B和

3、HLAII类分子，只表达多态性十分有限的HLA—E、一F、一G，同时低水平表达HLA—C分子。与之对应的是，妊娠早期母体子宫蜕膜部位有大量子宫NK细胞(CD56brilhtCDl6““)、巨噬细胞和T淋巴细胞侵润，其中子宫NK细胞占淋巴细胞总数的85％以上。近年来迅猛发展的NK细胞受体理论，极大地推进了NK细胞功能调控机制的研究。NK细胞上表达多种受体，包括能够特异性识别MHCI类分子的NK细胞受体。这些受体识别、结合相应配体后，通过传递活化性或抑制性信号，协同调节NK细胞活性。结构上，MHCI类分子特异性NK细胞受体主要有

4、免疫球蛋白样受体(KillerIg—IlkeReceptor，KIR)、免疫球蛋白样转录物(Immunoglobulin—likeTranscripts，上海第=医科大学博士学位论文中文摘要ILT)和c型凝集索样受体(c—typeLectinReceptors)3大受体家族。表达在胎儿绒毛外滋养层细胞上的HLAI类分子通过相应受体，调节NK细胞功能。KIR家族受体KIR2DL4，是HLA-G分子的特异性受体，且特异地分布在子宫NK细胞上，提示它可能在维持母胎免疫耐受中起重要作用。本课题从以下几个方面探讨KIR2DL4的生物学

5、功能及在母胎免疫耐受中可能的作用。第一部分蜕膜组织NK细胞受体表达分析为了探讨子宫蜕膜组织中NK细胞受体的分布格局及表达水平与母胎免疫耐受之间的关系，我们采用RT—PCR和免疫组织化学法检测了10例早期自然流产患者和40例同期正常早孕要求行人工流产者蜕膜组织的NK细胞受体mRNA的分布格局及KIR2DL4分子的表达特点。结果显示，KIR2DL4mRNA表达频率最高，早期自然流产组和对照组的阳性率分别为100％、95％。其次是KIR2DLl，阳性率分别为80％、75％。ILT2、ILT4mRNA表达阳性率较低，两组阳性率分别为

6、30％、30％和10％、7．5％。统计学结果显示，本实验所检测的NK细胞受体mRNA表达频率在两组之间无显著性差异(P>O．05)。提示NK细胞受体mRNA分布频率与早期自然流产的发生可能无直接关系。免疫组化法对早期自然流产病人组和对照组的蜕膜组织KIR2DL4分子表达进行分析。结果显示，KIR2DL4分子主要分布在毗邻子宫腺体的蜕膜基底细胞上，对照组KIR2DL4分子在蜕膜组织中的分布密度明显高于早期流产病人组，提示KIR2DL4分子表达水平的高低，可能影响早期胚胎的生长和发育。第二部分KIR2DL4与BLA-G分子的识别

7、特异性研究HLAI类分子al结构域中第77～83位氨基酸残基是KIR分子特异性识别的结构基础，该区域中，76位蛋氨酸及79位谷氨酰氨是HLA-G分子所特有的。KIR2DL4是HLA—G分子的特异性受体，与HLAI类分子相同，KIR2DL4识别位点位于HLA—G分子的Q1结构域。为探讨HLA-G独特的Met”、Gln”对KIR2DL4识别特异性的影响，本研究成功构建了表达KIR2DL4胞外区和IgGFc融合蛋白的真核表达载体CD51negl一2DL4，并使KIR2DL4一Ig融合蛋白在COS-7细胞中获得功能性表达。COS一7

8、细胞培养上清液经亲和纯化及浓缩后，采用抗人IgGFc抗体、抗KIR2DL4mAb#33和羊抗小鼠IgG抗体，ELISA结果显示有融合蛋白表达。SOS—PAGE结果显示重组载体转染的COS一7细胞培养上清液中有一鼢66000左上海第=医科大学博士学位论文中文摘要右的特异性条带，Western