花旗松素和落妇新苷在caco-2细胞单层中的转运(2(、(3)

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1、说明：黑色部分均是内容，蓝色部分为解释。1.转运试验前准备工作：取在Transwell板上培养21天的Caco-2细胞，选择跨膜电阻(TEER)>400Ωcm2,荧光黄的表观渗透参数≤0.5×10-6cm/s的细胞单层进行药物转运实验。Transwell板:一种细胞培养板，具微孔滤膜。实验前细胞用预热至37℃的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)漂洗2次，37℃预孵育30min,使细胞有充分时间适应转运介质，同时在不破坏其单层细胞膜的基础上除去细胞表面的杂质.Hank's液（HBSS）是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。2.

2、转运实验：1)在Transwell板的顶侧（AP)加入0.5ml含不同浓度花旗松素或落新妇苷的HBSS，作为给药室，同时在底侧（BL）加入1.5ml空白HBSS，作为接受室，进行由顶侧至底侧方向的转运。2)当考察由底侧至顶侧方向的转运时，需在BL侧加入1.5ml含不同花旗松素或落新妇苷的HBSS，作为给药室，同时在AP侧加入0.5ml空白HBSS，作为接受室。Transwell板的顶侧（AP)和底侧（BL）底侧（BL）顶侧（AP）(个人猜想转运的动力可能是浓度差)将Transwell板置于37℃恒温温床中孵育，转速50r/min,并分别于试验开始后30、60、90、1

3、20及180min,从接受室中吸取100μL接收液，立即补充相同体积的空白HBSS。接收液中花旗松素与落新妇苷浓度以HPLC-UV法测定。3.转运蛋白抑制剂对花旗松素和落新妇苷在Caco-2细胞中转运的影响：考察P-糖蛋白抑制剂维拉帕米、MRP2抑制剂MK-571对花旗松素和落新妇苷在Caco-2细胞中转运的影响，用含100μmol/L维拉帕米、50μmol/LMK-571的HBSS替代上述实验中的空白HBSS进行实验。具体操作步骤：Ø在Transwell板的顶侧（AP)加入0.5ml含不同浓度花旗松素或落新妇苷的HBSS，作为给药室，同时在底侧（BL）加入1.5ml

4、100μmol/L维拉帕米或50μmol/LMK-571的HBSS，作为接受室，进行由顶侧至底侧方向的转运。Ø当考察由底侧至顶侧方向的转运时，需在BL侧加入1.5ml含不同花旗松素或落新妇苷的HBSS，作为给药室，同时在AP侧加入0.5ml100μmol/L维拉帕米或50μmol/LMK-571的HBSS，作为接受室。将Transwell板置于37℃恒温温床中孵育，转速50r/min,并分别于试验开始后30、60、90、120及180min,从接受室中吸取100μL接收液，立即补充相同体积的100μmol/L维拉帕米或50μmol/LMK-571的HBSS。接收液中花

5、旗松素与落新妇苷浓度以HPLC-UV法测定。3.温度对花旗松素和落新妇苷在Caco-2细胞中转运的影响考察温度对花旗松素和落新妇苷在Caco-2细胞中转运的影响时，具体操作按“2.转运实验”所述步骤，不同之处在转运实验在4℃条件下进行。即取一带盖容器，装入冰后盖好盖子，放入摇床中平衡，使容器中的温度降至4℃左右，然后将用于转运实验的Transwell培养板放入装有冰的容器中，连同容器一起放入摇床中进行转运实验，实验中所用试剂均冰浴保存，备用。5.转运液中花旗松素和落新妇苷的HPLC测定：1)色谱分析条件：采用WatersSymmetryC18柱（1500mmX4.6m

6、m，5μm)和C18保护柱，柱温30℃；检测波长291nm；流动相为甲醇-0.3%醋酸溶液（35：65），流速1.0mL/min：进样量20μL。2）样品处理：取转运实验后样品溶液，经1300r/min离心10min,取上清液进样测定。