疆牛环形泰勒虫tams1基因的克隆 表达与巢式pcr诊断方法的建立

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1、中文摘要牛环形泰勒虫病是由泰勒科泰勒属的环形泰勒虫寄生于牛体内引起的以高热、贫血、出血和体表淋巴结肿大为主要临床症状的一种血液性原虫病。本病在新疆广为流行，严重危害着养牛业的健康发展。本研究参照GenBank上已发表的Tamsl基因序列设计了一对引物，采用PCR技术，成功从新疆焦虫病疫区感染牛的全血中扩增到Tamsl基因，该基因长度为846bp，编码281个氨基酸。序列分析表明，该基因与其他9个国际流行虫株的核苷酸同源性为93．6％．-99．8％，氨基酸同源性为88．6％．-99．6％。系统发育进化树分析表明，新疆分离

2、株同印度株、毛利塔尼亚株、土耳其株、北非的共和国株进化途径一致，与苏丹株和巴林株进化途径相差较远：氨基酸抗原决定簇分析发现新疆分离株编码的氨基酸有13个抗原决定簇。在上述研究基础上，成功构建了原核表达载体pGEX-4T-2／Tamsl，经IPTG诱导后表达后，进行SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果表明，pGEX-4T-2／Tamsl在大肠杆菌BL21中成功表达，为56KDa融合性蛋白，能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别，表明该融合蛋白具有较好的反应原性。根据编码30KDa环形泰勒虫裂殖子主要表面抗

3、原(Tamsl)基因序列设计2对巢式引物，建立牛环形泰勒虫巢式PCR快速检测方法．结果表明，PCR扩增产物测序结果与GenBank收录的Tamsl序列同源性在92％,-,99％，该PCR方法对环形泰勒虫是特异的，并具有良好的重复性和稳定性。用该方法对新疆焦虫病疫区牛群血样进行检测，结果巢式PCR检出率62．2％(6l／98)，并高于普通PCR检出率58．2％(57／98)和血涂片镜检检出率35．7％(35／98)。证明该巢式PCR可用于环形泰勒虫病疫区流行病学调查．关键词：牛环形泰勒虫，Tamsl基因，克隆与表达，巢式

4、PCR建立IIIAbstractTheileriaannulataisatick-borneprotozoanparasitethatmultipliesinerythrocytes，causingmildhyperthermiaandanemia．Wheninfectedcalvesareunderstress,suchasmixedinfectionwithotherparasitesorvirusg爆，theyshowseveresymptomsandoccasionallydie．Theileriosisiso

5、neofthemosteconomicallyimportantdiseasesofgrazingcattleinXinjiangarea．Toanalyzegenesequenceofthebovine刀leileriaannulatainXinjiang,apairofprimersWasdesigned,Tamslgenefragmemwa$amplifiedbyPcR,Andsequenceofpositivecloneswasshowedthatthegenefragmenthasatotallengthof

6、846bp，whichencoded281amineacids．Thehomologyofthenucleotideseqllencewas93．6％一99．8％．andhomologyoftheAminoacidsequencewas88．6o／旷99．6％comparedwitllother9internationalprevalent删ns．ThephylogenetictreewasshownthattheisolatedXinjiangstrainiscloselyrelatedtootherstrainsf

7、romIndia,Mauritania,Turkey,Tunisia,butnottothosefromBahrainandSudan．TheanalysisofantigenicdeterminantWasshowedthattheXmjiangisolatedstrainhave13antigenicdeterminants．Basedonthestudymentionedabove，pGEX-4T-21TamslexpressionplasmidWasconstructedsuccessfullybyinsert

8、ingtheTamsIgeneintopGEX-4T-2vector．ExpressedproteininducedbyTPTGWasanalyzedbySDS—PAGEandWestern-blotting．Theresultsshowedthatthe56KDaexpressedfusionproteinwasrecogniz