版纳微型猪近交系清瘦亚系和肥胖亚系猪fosmid基因组文库的构建

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1、版纳微型猪近交系清痩亚系和肥胖亚系猪Fosmid基因组文库的构建苏俊律娜朱宝利刘维全中国农业大学生物学院/国家级实验教学示范中心中国科学院微生物研宄所摘要：版纳微型猪(Susscrofa)近交系是世界上第一个中大型哺乳类实验动物近交系，其基因高度纯合、遗传背景清楚，在遗传育种、功能基因研究、人类疾病模型和异种器官移植等方面有巨大疲用潜力。但因高度近交衰退导致后代存活率低,基因资源非常珍贵，对这些遗传信息的保存具有重要科学和实际意义。本研究从染色体低熔点胶预包埋片中提取版纳微型猪近交系清瘦亚系猪和肥胖亚系猪DNA,通过物理方法剪切DNA到合适大小片段(约

2、36'8kb)，使用CopyControl™FosmidLibraryProductionKit试剂盒构建了这两个亚系猪的基因组Fosmid文库。随机选取3管文库菌液涂布平板，通过计算单位菌液单克隆数估算文库克隆数，清瘦亚系猪约30万个克隆，肥胖亚系猪约40万个克隆，对基因组的覆盖率分别达到4.4倍和5.9倍。以猪的心肌脂肪酸结合蛋白(heart-typefattyacid-bindingprotein,H-EABP)基因调控序列为研究对象，从构建的文库中筛选目的基因阳性克隆。设计该基因片段上下游引物，釆用“文库菌液PCR—一含阳性管菌液稀释一一稀释菌

3、液PCR—一单克隆菌液PCR”的分级菌液PCR方法进行筛选。逐级将PCR阳性菌液进行稀释，直到含目的基因的阳性管菌液滴度约1001000CFU/10uL时，将阳性管菌液涂布到含氯霉素LB平板37"C过夜培养，之后将单菌落转移到96孔板进行单克隆培养，再通过菌液PCR筛选目的基因单克隆，测序确定。最终从清瘦亚系猪Fosmid文库中筛选到5个目的基因单克隆。利用同样方法可从肥胖亚系猪文库中筛选B的基因克隆。版纳微型猪近交系清瘦亚系猪和肥胖亚系猪全基因组Fosmid文库的构建，对基因组的覆盖率高，理论上筛选到目的基因的概率达99%，为保存版纳微型猪近交系这一

4、特色种质资源基因组以及深入开展分子遗传育种、基因序列功能等研究工作奠定重要基础。关键词：版纳微型猪近交系;Fosmid基因文库;分级PCR;作者简介：刘维全,weiquan8@126.com收稿日期：2017-06-14基金：国家转基因重大专项(No.2009ZX08009-140B)ConstructionoftheFosmidGenomicLibraryfortheLeanSublineandtheFatSublineofBannaMiniatureInbredPig(Susscrofa)SUJunLVNaZHUBao-LiLIUWei-QuanC

5、ollegeofBiologicalSciences，ChinaAgriculturalUniversity/NationalBiologyExperimentalTeachingDemonstrationCenter;InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences;Abstract：BannaMiniatureInbredPig(Susscrofa)isthefirstlargeinbredmammalexperimentalanimal.Itsgeneishighlyhomozygous,andge

6、neticbackgroundisclear.Anditsgenehasgreatpotentialingeneticbreeding,functionalgeneresearch,humandiseasemodelandxenotransplantation.However,duetothehighdegreeofinbreedingdepression,thesurvivalrateofoffspringislowandgeneticresourcesareveryprecious,andthepreservationofthegeneticinf

7、ormationhasscientificandpracticalsignificance.Inthispaper,thelcansublincpigandthefatsublinepigweretakenastheresearchobjects.Thetwosublinepigs’DNAwasextractedfromagarosepre-embeddinglumps,andshearedtotheappropriatesize(about36'8kb)byphysicalmethod.Andthen,theDNAfragmentswereusedt

8、oconstructthetwosublines’FosmidlibrariesbyCopyC