hiv1整合酶s119de2c融合蛋白的定向整合及其整合位点的预测和分析

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1、浙江大学博士学位论文中文摘要中文摘要本研究有两个主要目的，首先研究HIV．1整合酶通过一定修饰后，在人类基因组上定向整合的能力，为后续的HIV．1整合位点偏好性研究提供实验依据；其次使用支持向量机(SupportVectorMachine，SVM)的方法，通过对已知HIV一1整合酶的整合位点附近DNA序列的学>--O，建立一个能够有效预测整合位点的生物信息学模型。实验方法1．为了研究HIV．1整合酶的定向整合功能，我们对野生型HIV．1整合酶引入S119D突变，然后使其与多锌指蛋白E2C融合。该融合蛋白能够特异性地识别人类基因组上的特定D

2、NA序列位点。融合蛋白通过反式包装(intrans)进入HIV．1病毒载体，感染细胞后，依次使用生物素引物标记、磁珠富集以及接头介导PCR等方法，对HIV．1整合酶S119D／E2C融合蛋白定向整合位点附近的DNA进行富集和扩增，最终用454测序获得全基因组上的整合位点信息。2．为了解决上述实测整合位点实验周期长的弊端，我们对基因组综述序列(GenomeSurveySequences)数据库中已有的HIV．1整合位点序列进行了整理，提取最可靠的基因组单一匹配序列作为训练数据集。根据支持向量机的算法，使用LibSVM、Matlab和自编的P

3、eal脚本程序对训练数据集进行学习、训练，以建立准确率较高的预测模型，并用于进一步分析。期望通过该模型对HIV．1整合位点序列的预测，获得HIV．1整合酶修饰特征与定向整合能力间相关性评估数据，用于指导设计更优化的实测性研究。结果1．首先，通过实验证明了在对HIV．1整合酶的修饰并反式包装进入病毒的过程中，病毒的包装和感染能力没有明显下降，提示其仍保持作为载体的生物学特征。其次，使用包含不同融合酶及其突变体和融合蛋白的病毒对HEK293T细胞系进行感染，提取、扩增整合位点序列，进而使用454测序法对相应整合位点的分析表明：与野生型整合酶相

4、比，整合酶和E2C融合蛋白在基因组上更倾向在“e2c位点”附近发生整合反应，提示达到了提高在基因组定向整合的能力的预期目标；Il浙江大学博士学位论文中文摘要整合酶S119D突变体降低了HIV．1整合位点处对序列的选择性，提示其随机性插入偏好性可由此得到适当的控制。2．通过支持向量机的统计学习方法建立了对HIV．1整合位点的预测模型，其预测准确率达到了82．09％(AUC-o．8678)．具体的建模过程表明，支持向量机在整合位点预测过程中，训练数据集需要的整合位点数最少在500～1000个。该模型的预测结果，与实验得到的HIV整合位点序列的

5、特征基本一致。我们不仅预测到整合反应偏好的序列，还预测到一些整合反应最不偏好的序列，并分别命名为热点序列和冰点序列。冰点序列目前尚无法通过实验手段得到。结论在宏观水平上，借助多锌指蛋白E2C特异性结合DNA的功能，一定程度上实现HIV．1载体向人类基因组上特定位点的定向整合；在微观水平上，整合酶的S119D突变降低了整合位点DNA序列上的偏好性．这两个层次的特点在解决HIV-1对基因组整合位点的选择和可控性上提供了有益的借鉴．使用支持向量机建立起相应的预测模型，为相关实验的前期设计和分析提供有效的信息，可以有效地克服现有实验技术和工具的局

6、限性。关键词：HIV-1，整合酶，E2C蛋白，定向整合，支持向量机浙江大兰堕主兰垡笙奎茎兰塑茎ABSTRACTOurfirstaimistoconstructsomefusionproteinsofHIV-1integrase(S119D)andpolydactylzinc．-fingerproteinE2Ctoperformatargetedintegration．Thesecondaimistoestablishasupportvectormachinemodeltopredictthepotentialintegrationsite

7、sbylearningcurrentintegrationsitesobtainedbyexperiments．Methods1．Tostudythetargetedintegration,weintroducedamutationS119Dtointegrasefollowingfusionwithapolydactylzinc·fingerproteinE2C，whichbindstoauniquesiteinhumangenome．TheINS119D／E2Cfusionproteinswerepackagedintovirus／n

8、trans．Afterinfection,usingbiotinlabeledprimers，streptavidinmagneticbeads，ligation．mediatedPCRand