色法流式细胞术检测cd4+、cd25+调节性t细胞foxp3的方法

《色法流式细胞术检测cd4+、cd25+调节性t细胞foxp3的方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法王琦1张行1邵雁2陈大方1陈萍1曹江1目的为探讨甲状腺患者外周血中Foxp3+∕CD4T细胞的表达及在甲状腺恶性肿瘤患者外周血手术前后的临床意义。方法建立流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法。结果外周血中Foxp3+∕CD4T细胞平均比例，体检健康组为3.7629±1.9996%，甲状腺恶性肿瘤术前组为9.1492±6.4704%，术后组为7.4435±6.3587%。结论甲状腺恶性肿瘤患者Foxp3+∕

2、CD4T细胞平均比例明显高于体检健康者（P＜0.05）。而甲状腺恶性肿瘤患者术后Foxp3+∕CD4T细胞平均比例则低于术前。关键词:流式细胞术、甲状腺癌、Foxp3CD4+、CD25+调节性T细胞是天然产生的调节性T细胞的重要亚群之一，在稳定的自身免疫环境中发挥重要的作用[1]。Foxp3特异性地表达在CD4+、CD25+Treg细胞上，并在该细胞的发育和功能维持中起很重要的作用，进而提示Foxp3可能是CD4+、CD25+Treg细胞的一个特征性标志[2]。近几年的研究发现调节性T细胞有可能以

3、某种机制抑制着机体对肿瘤的免疫应答，从而导致肿瘤的发生[3]，目前调节性T细胞与肿瘤免疫机制及治疗的研究逐渐成为热点。甲状腺癌是最为常见的内分泌恶性肿瘤之一，占头颈部肿瘤的首位，本研究为探讨Foxp3+∕CD4T细胞在甲状腺恶性肿瘤患者外周血手术前后外周血中的表达，我们建立三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法，并讨论其临床意义。1材料与方法1.1临床资料与分组：收集甲状腺癌患者（2007年11月～2008年2月期间本院住院患者）外周血共41例，术前24例，其中的17

4、例患者术后7天取外周血，行流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3检测，所有患者手术标本均经组织病理学诊断。健康对照组21例，为本院体检中心体检健康者。1.2主要试剂和仪器：淋巴细胞分离(国药集团化学试机有限公司)，CD4-FITC、CD25-PE购自Caltag公司，Foxp3-PE-Cy5、IgG2a-PE-Cy5、Foxp3破膜试剂盒等均购自eBioscience公司，正常大鼠血清购自杭州联科有限公司。低温高速离心机（HERAEUSD-37520德国），流式细胞仪EPICSX

5、L型（BeckmanCoulter美国）。1.2方法：1.2.1外周血单个核细胞（PBMC）分离取患者外周静脉血4ml以EDTA抗凝，充分混匀。取10ml离心管，将4ml全血缓慢加在4ml淋巴细胞分离液上部，2000转/分钟室温离心20分钟。轻轻吸取中间白色的淋巴细胞层至另一管，2000转/分钟室温离心5分钟，去上清。加2mlPBS混匀，2000转/分室温离心5分钟，去上清。计数细胞后调整细胞浓度至1X106ml-1。1.2.2流式样本制备取200μl上述单细胞悬液，在对照管和实验管中分别加入10

6、0μl，且在两管中均加入CD4-Pcy5、CD25-FITC各5μl，4℃避光孵育30分钟。加1mlFlowcytometryStainingbuffer，混匀。2000转/分钟室温离心5分钟，去上清。对照管和实验管中各加入2ml破膜剂。4℃避光孵育45-60分钟。2000转/分钟，离心5分钟，去上清。对照管和实验管中各加入2mlPermeabilizationBuffer，2000转/分钟，室温离心5分钟，去上清。重复PermeabilizationBuffer洗细胞步骤一次。对照管和实验管各加

7、入100μlPermeabilizationBuffer，充分混匀，再加正常大鼠血清2μl，4℃避光孵育15分钟。无需PermeabilizationBuffer清洗细胞，直接在对照管中加入IgG1-PE2.5μl，实验管中加入Foxp3-PE20μl。4℃避光孵育至少30分钟。对照管和实验管中各加入2mlPermeabilizationBuffer，2000转/分钟，室温离心5分钟。去上清，重复PermeabilizationBuffer清洗步骤一次。加400ulPermeabilization

8、Buffer上机检测。1.3统计学分析：采用SPSS11.5软件进行统计学分析，组间差异以LSD法进行两两比较，P＜0.05为有显著性差异。2.结果2.1甲状腺恶性肿瘤手术前、后外周血中CD4+∕CD25+T细胞的平均比例：流式细胞术检测体检健康者外周血中CD4+∕CD25+T细胞的平均比例为22.4048±7.5827%，甲状腺恶性肿瘤术前外周血中CD4+∕CD25+T细胞的平均比例为19.7725±7.9942%，术后组为21.5765±9.1018%。无显著性差异（P＞0.0