cd4+ cd25+ foxp3+调节性t细胞在成人过敏性哮喘急性发作期和缓解

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1、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在成人过敏性哮喘急性发作期和缓解　　支气管哮喘是以气道高反应性和气道慢性炎症为特征的变态反应性疾病。Th1/Th2失衡理论在哮喘发病机制中一直占据核心地位[1]。但越来越多的研究[2-4]表明，T细胞亚群，尤其是具有负向调节功能的CD4+CD25+Foxp3+T细胞与哮喘发病密切相关。调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)为一群表型和功能特异的T细胞，在抑制初始T细胞的活化与增殖、介导免疫耐受方面发挥着重要作用。本研究旨在通过检测不同发病阶段哮喘患者外周血中CD4+CD2

2、5+Foxp3+Treg细胞的比例，探讨该细胞水平与哮喘患者病情的关系。　　1资料与方法　　1.1一般资料2010年1月-2011年5月在笔者所在医院呼吸内科住院患者中筛选出对尘螨过敏的哮喘急性发作期患者。在本院职工中招募志愿者，筛选无症状的尘螨过敏者和无过敏的健康志愿者。研究对象分为三组：(1)尘螨过敏的急性发作期组(24例)，其中男11例，女13例，年龄(35.21±11.39)岁。选择标准如下：符合GINA的诊断标准，在常见的过敏原中，仅对尘螨过敏，且5年内未接受免疫治疗，3个月内未使用口服激素或茶碱制剂，2周

3、未接触吸入激素治疗[5]。(2)无症状的过敏组(23例)，其中男11例，女12例，年龄(36.84±12.39)岁。无过敏症状，仅对尘螨过敏，且体格检查及实验室检查均未发现其他异常。(3)无过敏的健康人组(19例)，其中男10例，女性9例，年龄(34.91±10.27)岁。无过敏症状，对过敏原皮试阴性，体格检查及实验室检查未发现异常。所有研究对象近4周均未患过感染性疾病，无特殊病史。三组患者的性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。该研究符合笔者所在城市医疗卫生行业关于人类研究的相关伦理学要求

4、。所有研究对象均签署书面的知情同意书。　　1.2仪器与试剂过敏原皮试液采用Soluprick试剂(ALK，Horsholm，Denmark)；血清过敏原特异性IgE采用PhadebasRAST试剂(Pharmacia，MiltonKeynes，UK)；人淋巴细胞分离液(上海华精)；抗CD4-FITC、抗CD25-PE和抗Foxp3-PE-Cy5抗体及同型对照抗体，Foxp3固定破膜剂，PMA、离子霉素和莫能霉素(eBioscience，USA)；FACSCalibur流式细胞仪及分析软件(BectonDickinson，USA)。

5、　　1.3过敏原皮内试验及过敏状态的判定所有研究对象均在笔者所在医院呼吸内科门诊进行过敏原皮内试验。检测项目包括蟑螂、尘螨、混合草花粉等常见吸入性变应原，受检者进行右上臂外侧皮内试验，变应原溶剂作为阴性对照。皮内注射15min后观察结果：皮丘不增大，周围无红晕者为阴性；红斑直径较阴性对照增大4mm以上为强阳性。血清中相应特异性IgE通过放射性过敏原吸附试验检测。受检者无过敏症状，过敏原皮试均为阴性，血清过敏原特异性IgE均阴性(<0.34IU/L)判定为不过敏。　　1.4人外周血单个核细胞(PBMC)的制备及体外培养抽取外周

6、静脉血5ml，与肝素钠充分混匀，加入等量PBS溶液，稀释后备用；将稀释后的血液缓慢加到5ml淋巴细胞分离液的表面，4℃2000r/min离心30min，吸取白膜层即为外周血PMBC。PBS溶液洗涤后，取1106的PBMC于6孔细胞培养板中，3mlRPMI1640培养液(10%胎牛血清，25ng/mlPMA，1μg/ml离子霉素，1.7μg/ml莫能霉素)，置于37℃5%CO2培养箱中培养4h后收集，PBS洗涤后置BD流式管中待用。　　1.5流式细胞术检测及结果分析细胞分别加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE抗体各1

7、μL，4℃避光孵育30min，Foxp3固定破膜剂进行固定和破膜处理后，加入抗Foxp3-PE-Cy5抗体2μL，室温避光孵育30min。同时做同型对照。标记好的样本1h内流式细胞仪检测。　　1.6统计学处理流式细胞仪检测时采用CellQuest软件包，并进行数据分析。使用SPSS11.0软件进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析。如各组均数不全相同，进一步采用SNK法进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1流式细胞术检测外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞结果见图

8、1。　　图1流式细胞术分析人外周血单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+　　T细胞占CD4+T细胞比例　　注：a以同型对照染色样本为阴性对照；b-c以CD4+、CD25+T细胞设门，分析双阳性细胞中CD4+Foxp3+细胞占CD4+细胞的比例