合浦珠母贝c型凝集素基因及其snp位点分析

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1、/.'上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对●所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。}i≥学位论文作者签名：棚锯薮爵同期：a2川年匆月I2／F{上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，◆同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论

2、文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本版权书。指导教师签名：，肜本学位论文属于不保密∥●学位论文作者签名：钥铌破舀∥¨期：刃lJ年6月I易同只期：们，年石月、'••上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注●毂‘上晦i毛强欠譬彳i毒毛主席硼铆许占弗菘爱委员参l霞杉馋向枷犬溽袤磺委员委员委员委员委员●秘书答辩地点南海水产研究所答辩日期2011

3、．6．12●••••上海海洋大学硕士学位论文合浦珠母贝C-型凝集素基因及其SNP位点研究摘要■合浦珠母贝(Pincatadafucata)又称马氏珠母贝，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的低纬度海区，在我国主要分布于广东、广西和海南等沿海地区，是我国生产海水珍珠的主要贝类之一，其生产的珍珠具有极高的经济价值。本研究在合浦珠母贝cDNA文库构建和测序的基础上，经过EST序列比对，获得2个合浦珠母贝C一型凝集素(C-typelectin)基因，分别命名为PoLECI和PoLEC2，分析了PoLECl和PoLEC2的序列特

4、征和组织表达调控模式，对PoLECI进行了原核重组表达及功能分析，证实了其具有凝集细菌的活性，同时，克隆了PoLECI基因组，经分析和筛选，获得了30个SNP位点，分析其与露空胁迫抗性的相关性，证实了PoCL-S18和PoCL-S26位点与抗露空胁迫显著相关，为合浦珠母贝分子标记辅助育种奠定了基础。1．PoLECl的序列、表达和功能分析PoLECI全长998bp，5’-UTR为33bp，3’-UTR为101bp，开放阅读框为861bp，●编码287个氨基酸，分子量为31．68kDa，理论等电点约5．83。预测的氨基酸

5、序列中含有信号肽(Met’-Serl9)和糖识别结构域，糖识别结构域中存在6个保守的半胱氨酸和1个糖结合位点。同源性分析结果表明，PoLECl与其它物种c一型凝集素的糖识别结构域序列同源性在16．旷27．3％之间，相似性在28．9—48．5％之间。进化分析结果表明，PoLECl与栉孔扇贝聚为一支，与无脊椎动物亲缘较近。组织表达模式分析表明PoLECImRNA在肝胰腺，外套膜、性腺、闭壳肌、肠、鳃和血淋巴组织均有表达，在肝胰腺中的表达量最高。经溶藻弧菌刺激后，PoLEClmRNA在肝胰腺中的表达分析结果表明，在刺激后2

6、h表达显著下调，而在4h和24h表达显著上调。利用PoLECI成熟肽序列构建原核表达载体，在大肠杆菌中进行重组表达，用HisBind树脂纯化得到PoLECI重组蛋白，细菌凝集实验表明其对大肠杆菌和芽孢杆菌有明显的凝集作用。●2．PoLEC"2的序列分析和组织表达分析PoLEC2全长为1659bp，5’-UTR为39bp，3'-UTR为45bp，开放阅读框为1575bp，可编码525个氨基酸，分子量约58．03kDa，理论等电点为5．22。PoLEC2氨基酸含有信号肽序列(M1_A16)、一个MAId-2结构域和一个c

7、_型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明，PoLEC2与其它物种C一型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26．5-33．6％之间，相似性在45．1-55．6％之间。进化分析结果表明，合浦珠母••••上海海洋大学硕士学位论文贝与贻贝在进化树同一个分支上。组织表达模式分析表明PoLEC2mRNA在肝胰腺、外套膜、性腺、闭壳肌、肠和鳃组织均有表达，且在肝胰腺·}J的表达量最高。经溶藻弧菌刺激后24h，PoLEC2mRNA在肝胰腺中的表达显著上调；刺激后8h在肠中的表达量显著上调。■}3．PoLECl基因组的SNP分析在

8、PoLECl的cDNA序列中设计引物，进行基因组扩增，成功地获得了基因组序列，全长4943bp，包括4个外显子和3个内含子，3个内含子的剪切位点都符合典型的GT／AG法则。同时，通过对基因组DNA的PCR产物直接测序，获得30个SNP位点，其中13个是内含子SNP，17个是外显子SNP，有13个cSNP是错义SNP引起氨基酸的变化。这些SNP位