notch受体的配体deltalike1蛋白表达纯化及其性能研究

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1、西北大学硕上学位论文Notch受体的配体Delta．1ikel蛋白表达、纯化及其性能研究摘要在胚胎时期和出生后生长时期，Notch信号通道在细胞的增殖、凋亡等方面都起着重要作用，而成为治疗人类疾病(如癌症)的～种潜在方法。由于Notch信号具有促进造血干细胞自我更新，抑制分化的功能，所以激活N0tch信号有利于干细胞的扩增。目前，在哺乳动物中已发现5种_Notch配体(Jaggedl、Jagged2、Del诅_likel、Del协Iike3和De【诅一like41。其中Hum姐Del协1ikel(简称hDlll)由737个氨基酸组成，是单次跨膜蛋白，其胞外段中有1个DSL基序和8个EGF样结构

2、域。可溶性的人Delta-1具有延迟鼠类造血祖细胞分化和促进早期祖细胞扩增的功能。为了更加深入地研究可溶性人De】ta-iikel(1Dlll)片段，进行造血干细胞移植的体外扩增实验，我们利用重组uNA技术和液相色谱技术在体外进行了细胞外的两个hDlllchDlIl(127-225)和hDIIl(26乏25)】基因片段克隆、表达和复性与同时纯化的研究，所获得的结果：舟为建立造血干细胞的体外快速大量增殖体系和开展慢性粒细胞白血病造血干细胞移植治疗提供实验支持，以期解决临床造血干细胞治疗中干细胞来源不足的困难。正文主要包括两个部分：1、可溶性人DeJta-Jjkel在西曲mm缸∞盯中的表达及其发酵

3、工艺的研究根据天然hDlll基因序列，我们设计合成了PCR引物，以人肝脏的cDNA为模板进行PCR体外扩增获得编码成熟肽的GsT．hDlll基因。将测序正确的hDlll【hDlll(127—225)】基因片段与谷胱甘肽一s一转移酶(GST)融合于pGEx4T一1表达载体，重组质粒pGEX4T．1GSthDlll转化入西c矗erfc觚2c口ZfDH5旺中，经IPTG诱导在髓c^Pr配^抽c。，f中获得了表达，其表达的蛋白主要以包涵体形式存在。并在此基础上，进一步对摇瓶培养中西c^F，fc厅妇∞，f生长和GsT-hDlll表达的影响因素(培养基、碳源、温度、pH、溶氧等)进行了优化筛选。结果确定M

4、9为本实验基础培养基，以每50mLM9培养基／250mL摇瓶，初始pH7．2，甘油为碳源，转速210r／min，在30。c培养至0D600达到0．7—1．O时，加入IPTG(O．6咖l／U诱导表达5h时，目的蛋白的表达量为42．9％。菌体经5L发酵罐培养，ll西北大学硕l。学位论文其结果显示：流加发酵方式培养优于分批发酵，前者的产量为24．O∥L细胞湿重。2、可溶性人Delta．Iikel包涵体回收及其液相色谱复性与同时纯化工艺的研究将5L发酵罐获得的菌体重悬于配制好的缓冲液中，进行超声破碎、多次洗涤后，将包涵体溶解于强变性剂(8moI／L脲或6—7mol／L盐酸胍)，利用蛋白折叠液相色谱技术

5、(亲和色谱、体积排阻色谱、疏水相互作用色谱和离子交换色谱)对溶解的包涵体分别进行复性并同时纯化。结果：(1)经亲和色谱柱其纯度达到97％，蛋白质量回收率为89％；(2)采用改进的脲梯度SEC法复性与同时纯化GST．hDIll，可使蛋白质量回收率由47％提高到62％，纯度也由90％提高到95％，将脲梯度纯化后样品进一步经反相液相色谱其目标蛋白纯度可达到99％；(3)初步利用HPHIC和腰c进行GsT_hDllI融合蛋白的复性与同时纯化的结果显示，通过进一步进行其色谱条件优化才能有可能提高纯化效率；(4)经SDS．PAGE、MALDI．TOF确认GsT_hDlll的分子量为39kD，与预期的结果一

6、致，其生物活性实验证实制备的GST-hDlll融合蛋白具有刺激Notch受体的作用。关键词：Notch受体，谷胱甘肽．s一转移酶．人Delta_likel融合蛋白，大肠杆菌，包涵体，蛋白折叠液相色谱，复性与同时纯化。I¨西北大学顾十学位论文Expression，purificationandcharacteristicsofatruncatedhumanDelta—likel，aligandofNotchreceptorsAbstract1heNotchsigIlalingpathwayplaysapivo伽roleinprolif宅ration，ap叩tosis，andsooninbomc柏

7、曲ryollic姐dpos协ataldeVelopmem，肌disapoteI城altller印eutictargetfbrhumalldiseasessuch弱callc瓯Notchisaf砌lyoftypeItr黜mernbraneproteinsthatincludesfollrm锄bersinmousea11dmaIl(Notchl-4)．FiveNotchligall出havebeeni