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1、抗肿瘤肝微粒体代谢种属比较研究报告目录15肢關32材料与方法32.1药品32.2样兄及预处理方法32.3仪器和条件32.4数据分析43结果43.1抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOFMS分析43.2UPLC-UV/Q-TOFMS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物43.2.1MO([M+H]m!z809.265)53.2.2Ml([M+H]+，m/z212.101)53.2.3M2([M+H]+,m/z364.129)53.2.4M3(
2、M+H广，m/z380.125)53.2.5M4([M+H]+,m/z464.147)63.2.6M5([M+H]+，m/
3、z480.142)63.2.7M6([M+H]+，m/z709.210)63.2.8M7([M+H]+,m/z825.259)6O吉i仑7醐8瞧231研究目的本研宂比较抗肿瘤在人、猴、犬、大鼠和小鼠五个种属肝微粒体屮代谢过程的差异，为临床前药动学和安全性评价研究动物种属的选择提供参考。2材料与方法2.1药品抗肿瘤储备液由美辿四普亚医药科技（上海）有限公司提供。2.2样品及预处理方法肝微粒体样品由美迪西普亚医药科技（上海）冇限公司提供。取肝微粒体双样本样品各60
4、iL合并，获得人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体的0min和60min样品。加入360
5、iL乙腈沉淀蛋白，离心10mi
6、n（4000rpm）。全取上清液于40（）C空气下吹干，残留物用120
7、IL乙腈/水（1:9,v/v）溶解，涡流混合。取2.0pL进行UPLC-UV/Q-TOFMS分析。2.3仪器和条件仪器美国Waters公司SynaptG2-Si型四极杆•飞行时间串联质谱仪（Q-TOFMS）,配有电喷雾电离源（ESI源）和AcquityUPLCH-CLASS液和色谱系统。色谱条件色谱柱为ACQUITYUPLCHSST3C18coIumn（2.1X100mml.D.,1.7gm粒径），美国Waters公司；柱温为45°C;流速为0.4mL/min;紫外检测波长200-600nm，流动相梯度
8、见下表。时间（min）A（水含0.1%甲酸）B（乙腈含0.1%甲酸）0.09551.59558.525759.559512.0955质谱条件离子源为电喷雾电离源（ESI）,正离子扫描方式检测，去溶剂气（氮气）流速为750L/h,去溶剂气温度为350（）C,源温度为120°C,毛细管电压为3.0kV。低能量扫描吋传输碰摘能量为2eV,阱碰摘能量为2eV;高能量扫描吋传输碰撞能量为12-18eV,阱碰撩能量为18-32eV。扫描范围为m/z50-1200。选取400ng/mL的亮氨酸-脑啡肽（m/z556.2771）作为质荷比校正外标物，流速为6pL/mino2.4数据分析采用
9、Waters公司的MasslynxV4.1软件进行数据采集，采用Waters公司的MasslynxV4.1中的子软件MetaboLynxXS进行数据分析。3结果3.1抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOFMS分析首先对抗肿瘤对照品溶液进行UPLC-UV/Q-TOFMS分析，推测质谱裂解规律，为其他代谢产物结构推测奠定基础。在本研究选取的色谱条件下，抗肿瘤的色谱保留时间为7.74min（阁1A和1B）,一级全扫描质谱图屮（图1C）,获得m/z809.265的准分子离子（[M+H]+）。在高碰撞能量下，产生m/z112.048、272.046、387.069、524.09
10、3、661.117和735.192的碎片离子。为了便于描述，将抗肿瘤结构中的两个羧酸酯键分别命名为酯键A和酯键B。推测的抗肿瘤的质谱裂解途径如图2所示。本试验将根据这些质谱断裂特点，鉴定抗肿瘤在肝微粒体中的代谢产物（阁3和4）。代谢物按照分子量和保留吋间依次命名。3.2UPLC-UV/Q-TOFMS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物与孵育0min的肝微粒体比较，在孵育60min肝微粒体样品中主要发现8种相关离子，其质荷比分別为m/z809.265、212.101、364.129、380.125、464.147、480.142、709.210和825.259,分别命名
11、为MO、Ml、M2、M3、M4、M5、M6和M7。其中M3检测到两个色谱峰，根据保留时间分别命名为M3-1和M3-2；M7检测到三个色谱峰，根据保留时间分别命名为M7-1、M7-2和M7-3。在人肝微粒体孵育体系屮检测到所冇代谢物MO、Ml、M2、M3、M4、M5、M6和M7（图3A）。在猴肝微粒体孵育体系中检测到Ml、M2、M3-1、M4、M5和M7-2（图3B）。在犬肝微粒体孵育体系中检测到MO、Ml、M2、M3-1、M4、M5、M6和M7-2（图3C）。在大鼠肝微粒体孵冇体系中检测到代谢物Ml、M2、M3-1
