sirna干扰介导cxcr4基因沉默在抑制恶性淋巴瘤转移中作用及机理

《sirna干扰介导cxcr4基因沉默在抑制恶性淋巴瘤转移中作用及机理》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、SiRNA干扰介导CXCR4沉默在抑制恶性淋巴瘤转移中作用及机理摘要：目的本研究拟通过RNA干扰技术抑制CXCR4基因的表迗，并观察其对淋巴瘤细胞侵袭转移能力的影响。方法设计合成CXCR4特异性小干扰RNA(siRNA)，并转染JURKAT细胞。通过qPCR检测CXCR4mRNA的表达，用Transwell小室体外细胞侵袭模型检测细胞体外侵袭能力。结果转染PRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4_siRNA的JURKAT细胞CXCR4基因表达明显受抑制；与对照组比较，其细胞侵袭能力亦明显降低。结论应用RNA

2、干扰靶向沉默技术，高效特异性地抑制淋巴瘤细胞CXCR4基因的表达，从而抑制肿瘤的侵袭能力。关键词：恶性淋巴瘤；siRNA；CXCR4恶性淋巴瘤是一组原发于淋巴结和(或)结外部位淋巴组织的淋巴细胞或组织细胞的恶性肿瘤。本研究拟通过RNA干扰技术，靶向沉默CXCR4基因的表达，观察其对淋巴瘤侵袭转移的影响。1材料与方法1.1材料与试剂人淋巴瘤细胞株JURKAT由南方医科大学南方医院血液病实验室惠赠；pRNAT-U6.2/Lenti购于GenScript公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于QIAGEN公司。1.2细

3、胞培养JURKAT细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI1640培养液，于37°C、5%C02恒温培养箱中培养，常规换液传代。1.3质粒载体的构建利用Takara、AMbion和PromegasiRNA靶序列分析设计系统，扫描人CXCR4cDNA编码序列，依据siRNA靶序列设计原则，经BLAST同源性分析。设计包含XholI和BamHI酶切残端的1对靶向CXCR4发卡样DNA寡核苷酸，由上海生工公司分别合成2对编码短发夹RNA序列的DNA单链，其序列如下：5’-GATC

4、CGGAACCCTGTTTCCGTGAATTCAAGAGATTCACGGAAACAGGGTTCCTTTTTTC-3?(sense)and5’-TCGAGAAAAAAGGAACCCTGTTTCCGTGAATCTCTTGAATTCACGGAAACAGGGTTCCG_3’(antisense)。选取其中一个序列打乱并无基因同源性作为阴性对照序列(NC)。其寡核苷酸序列：5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(sense)and5'-ACGTGACACGTTCGGAGAAT-3’(antisense)，用

5、XhoI和BamHI双酶切空质粒pRNAT-U6.2/Lenti，将退火形成的双链定向克隆至该真核载体上，经筛选后，再进行测序鉴定。1.4质粒转染及稳定筛选参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染，通过脂质体将表达载体(pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA)和空质粒(pRNAT-U6.2/Lenti)转染入JURKAT细胞，经G418筛选建立稳定传代的细胞系。1.5荧光定量PCR检测CXCR4mRNA表达采用Trizol法提取细胞总RNA，用AMV反转录酶进行反转录

6、，得到总cDNAo分别扩增目的基因CXCR4及内参对照-actin，引物序列如下:CXCR4上游引物5’-CAATGACTTGTGGGTGGTTGTG-3'，下游引物5’-ATGCAATAGCAGGACAGGATGA-3?；-actin上游引物5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3Z，下游引物5"-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-37。扩增条件：95°C预变性30s，95°C变性3s，60°C退火和延伸30s，循环40次。记录各管扩增CT值，换算出基因拷贝数。以CXCR4基因拷贝数

7、与-actin基因拷贝数的比值作为CXCR4相对表达水平。1.6Transwell小室侵袭实验以预冷的RPMI1640与Matrigel胶1:1稀释后，取100P1稀释胶加到Transwell上层小室中，于37°C孵育6h。收集各组细胞，消化成单细胞悬液，用含1%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，按5X104/ml个细胞的密度将100y1接种于Transwell上层小室。吸取含10%胎牛血清或10%胎牛血清+100ng/mlSDF-1的RPMI1640培养基500yl加入Transwell下层小室，置于37

8、°C、5%C02的培养箱中培养24ho用棉签沾PBS轻轻地擦去小室上层聚碳酸酯膜上贴壁生长但未能穿过膜的细胞。将膜取出放入预先装有95%乙醇的24孔板内固定lOmino吸弃乙醇，加0.1%的结晶紫染色30min，用PBS小心洗去多余的染料，翻转聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置载玻片上加中性树胶盖玻片封片。在200倍放大倍数下随机观察并计10个视野内穿过聚碳酸酯膜的细胞数，照相记录。重复3