二氧化硫诱导大鼠海马神经元损伤效应及其分子机制研究

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1、二氧化硫诱导大鼠海马神经元损伤效应及其分子机制研究【摘要】：随着中国大中型城市能源结构的转变以及大气污染源的变化，煤炭大气污染对环境和人群健康的危害将变得更为隐蔽，更易被忽视。在中国燃煤所造成的大气污染中，二氧化硫(S02)排放贡献率为85%，依旧领先于烟尘、氮氧化物以及二氧化碳等其他大气污染物。山西省是我国以煤炭为主要能源的重化工基地之一，在全省城市、工矿区以及居民集中的地区，大气SO2污染普遍存在，因此长期接触低浓度S02所引发的健康危害问题显得尤为突出。特别是近期相关研究显示S02污染与中枢神经系统损伤和疾病发生有关，由于艽超越了传统观念，提出Y新的、更为严峻的危害理念，得到

2、广泛关注。由此提出本课题，研宄S02对中枢祌经元的损伤效应，在此基础上探讨效应发生的可能信号通路。1.本课题通过对雄性Wistar大鼠进行动式S02熏气染毒，每天6h，连续7d，染毒剂量为7，14,28和56mg/m3,探讨了S02诱导海马神经元损伤的效应。采用分光光度法测定大鼠海马组织蛋G质羰基含量，采用酶联免疫技术测定海马组织促炎症因子白介素-l(3(IL-lp)和肿瘤坏死因子(TNF-ot)水平，采用荧光标记法测定海马组织胞内钙离子水平，采用实时定量RT-PCR和Westernblot分别测定海马组织凋亡相关基因c-fos，c-jun，p53，Bax和Bcl-2的mRNA和蛋

3、白表达，以及采用HE和TUNEL染色考察海马区切片的病理损伤和神经元凋亡的数量；并进一步通过原代培养大鼠海马神经元进行不同时问(6，12和24h)和不同浓度(3,10,30，100和30C^M)的S02衍生物暴露染毒，考察以上凋亡论文发表专家基因在暴露染毒前后mRNA和蛋白表达水平的变化。结果表明：S02可显著增加蛋白质羰基(PCO)含量；SO2可引起海马区促炎症因子IL-lp和TNF-a水平显著升高，且低浓度下作用明显；S02可显著增加神经元胞内钙离子(Ca2+)浓度；S02通过其衍生物显著上调海马神经元凋亡相关基因c-fos，c-jun和p53mRNA和蛋白表达，以及Bax和B

4、cl-2mRNA和蛋白的比值，且呈现明显的剂量-效应关系。这一结果分别从整体和细胞水平上，说明了S02对大鼠海马神经元的损伤效应，并提示此效应的发生与氧化应激、炎症反应和神经元凋亡密切相关，但其分子调控机制还不清楚。2.为了进一步阐明S02诱导海马神经元损伤的信号途径及环氧合酶-2(COX-2)作为此效应标记的可能性，本实验通过对原代培养大藏海马祌经元并进行S02衍生物暴露染毒，考察了S02诱导大鼠海马神经元凋亡效应及C0X-2作为此效应标记的可能性。在此基础上，通过特异性阻断技术按照“C0X-2表达增加—前列腺素E2(PGE2)通过其相应受体PGE2受体(EP24)调节谷氨酸释放

5、^N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体通道激活钙稳态改变神经元凋亡”的递进顺序，探讨效应发生的可能信号通路，确立阻断此通路的可能靶位点。结果表明：(l)S02衍生物上调大鼠海马神经元C0X-2表达，进而激活caspase-3诱导神经元凋亡；C0X-2抑制剂NS398和ShRNA沉默C0X-2基因表达可显著抑制S02衍生物诱导凋亡效应的发生(2)SO2衍生物可造成C0X-2催化AA合成的PGE2的过量释放并作用于其受体EP24,导致与其耦联的环腺苷酸(cAMP)水平明显上调，最终引发神经毒性；NS398和ShRNA沉默C0X-2基因表达可显著抑制此效应；(3)SO2衍生物诱导祌经元

6、损伤的可能信号途径为：S02吸入一＞通过其代谢衍生物形成自由基造成氧化损伤—炎症反应-C0X-2表达增加突触后PGE2水平升高并作用于突触前膜EP2/EP4受体调节谷氨酸释放—激活NMDA受体通道提高胞内游离钙离子浓度j神经元凋亡，在此过程中,C0X-2介导的花生四烯酸(AA)脂质代谢反应是一个重要的调控环节。3.为了在体条件下验证上述可能的信号途径及以C0X-2为标记的损伤效应，本实验通过对大鼠进行不同浓度S02动式熏气染毒和腹腔注射NS398预处理后再对大鼠进行S02熏气染毒，在体条件下考察该通路可能靶位点的表达变化。结果表明：S02吸入可显著增加海马组织C0X-2表达，PGE

7、2含量，EP2/EP4受体表达，cAMP水平和NMDA受体表达，诱导凋亡发生；腹腔注射NS398预处理后可显著抑制S02吸入诱导的C0X-2表达,PGE2含量，EP2/EP4受体蛋白表达，cAMP水平和NMDA受体(NR2B)蛋白表达的增加，及caspase-3的激活。本研宄阐明了S02对中枢神经元的损伤效应及C0X-2作为此效应标记的可能性，建立了检测和评价指标；确立了损伤发生的信号途径，找出了阻断的靶位点，为S02吸入后中枢神经系统损伤相关分子调控机制的研究和污染