临床医学毕业论文自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究

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1、自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研宄姓名：2014年6月25日自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研宄作者：蔡文君，谭长强，李玉瑾，黄和，李霜【摘要】目的：研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的Fas配体（FasLigand,即FasL）基因和白细胞介素10（即IL10）基因治疗实验性自身免疫性感音神经性聋。方法：采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型28只，按配对设计将其分为4组，通过鼓阶微量注射的方式，A组注入携带FasL基因的腺病毒（AdFasL）,B组注入携带IL1

2、0基因的腺病毒（AdIL10）,C组单纯注入腺病毒（携带绿色荧光蛋白，即AdGFP）,D组注入等量的磷酸盐缓冲液。基因导入7d后行听觉脑干诱发电位（ABR）测试，后取颞骨制作石蜡切片并行HE染色和光镜观察，每组各取两耳行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察。每组各取3只（6耳）行免疫荧光和酶免疫组织化学试验，以检测基因产物表达和腺病毒转染情况。结果：免疫组织化学显示携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋祌经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞，并产生相砬的蛋白产物（IL10和FasL）

3、。ABRlir波阈值的均值对比结果显示，A组和B组明显低于C组和D组。内耳组织的免疫炎性反应亦明显较C组减轻。结论：重组复制缺陷型腺病毒可以携带目的基因转导入内耳，并在内耳表达基因产物，其抑制炎症反应的作用可有效地减轻&身免疫性感音神经性聋的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍，有望成为治疗自身免疫性感音神经性聋新的方法和途径。【关键词】基因治疗；自身免疫性感音神经性聋；豚鼠1979年McCabe依据其临床发现，即18例听力障碍患者经过免疫抑制治疗后听力有明显改善，提出了自身免疫性感音神经性聋（autoimmun

4、esensorineuralhearingloss,ASNHL）的概念。之后的进一步研究发现，自身免疫性损害不仅可累及耳蜗，还可波及前庭，故又提出了自身免疫性内耳病（autoimmuneinnereardisease,AIED）[12]概念。目前ASNHL的病因和发病机制尚不十分清楚，临床缺乏特异性诊断方法，对于ASNHL患者的治疗亦存在着一些问题，主要是采用皮质激素或免疫抑制剂治疗，虽然疗效较快、较好，但该类药物毒副作用多，而且还存在停药后复发率较高等问题。近年来随着分子生物学研究的深入和基因工程技术的进展，

5、基因治疗已成为许多相关疾病治疗研宂方而的热点和新希望。棊因治疗是根据特定的治疗FI的基因将DNA导入到宿主细胞屮并在其屮表达。1996年Lalwani等［34］报道了将基因导入动物内耳，以后关于内耳的基因治疗成为一个热点，并在载体选择、导入方法和安全性评估等方面取得了很大的进步。基因工程技术已能构建特异性载体，可携带治疗基因导入动物耳内，在动物内耳获得高效表达［4］，产生具有高度生物活性的稳定的基因产物，并且不产生病毒相关的耳毒性反应，这为基因治疗感咅神经性聋提供了生物学证据。目前因为复制缺陷性腺病毒载体其有病

6、毒滴度高、转染效率高（100%）、宿主细胞范围广、外源基因容量大、稳定和无插入突变危险等特点，己经成为基因转导研宂中应用最多的载体之一。Yagi等［5］将腺病毒携带的GDNF基因从圆窗膜注射入鼓阶，GDNF基因在蜗内得到表达并发挥作用。基于上述研究状况和现有研究工作基础，木项目组拟将利用基因治疗的独特性和内耳可行局部治疗的独特解剖特点，对自身免疫性感音神经性聋模型动物进行内耳免疫抑制或调节基因的试验性治疗研宂，以探讨其治疗效果和可能发生的副反应情况。1材料和方法1.1实验动物健康成熟豚鼠，白色红0，体重300g

7、左右，耳廓反应正常，耳镜检查排除中耳疾患，所有动物均由南京青龙山养殖场提供。1.2内耳组织粗制抗原(crudeinnercarantigens,CIEAgs)制备豚鼠CIEAgs制取方法参考文献［4］,主要步骤：将豚鼠清醒断头，取出颞骨，快速打幵听泡，在解剖显微镜下分离全膜迷路，包括基底膜、螺旋韧带、膜半规管、椭圆囊和球囊(祛除耳石器)，放入0.01moLL-1pH7.4PBS中，经研磨、冻溶、超声粉碎、匀浆、离心(1000rmin-1,5min)后取上清液，采用紫外分光光度计测定蛋白含量，分装后低温干燥制成C

8、IEAgs干粉备用，保存于-80°C冰箱。1.3ASNHL动物模型制备首次免疫每只动物采用CIEAgs400mg，(0.4ml)-1，加等量完全弗氏佐剂，注射于右后足垫；2周后以CIEAgs200mg*(0.4ml)-1加等量不完全弗氏佐剂，注射于背部多点皮K;间隔2周后，再同样强化免疫1次。依据听觉诱发电位III波的阈值升高(超过免疫前全部动物均值加2倍标准差)和出现针对CIEAgs