自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究

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1、自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究：蔡文君，谭长强，李玉瑾，黄和，李霜【摘要】目的：研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的Fas配体（FasLigand，即FasL）基因和白细胞介素10（即IL10）基因治疗实验性自身免疫性感音神经性聋。方法：采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型28只，按配对设计将其分为4组，通过鼓阶微量注射的方式，A组注入携带FasL基因的腺病毒（AdFasL），B组注入携带IL10基因的腺病毒（AdIL10），C组单纯注入腺病毒（携带绿色荧光蛋白，即AdGFP），D组注入等

2、量的磷酸盐缓冲液。基因导入7d后行听觉脑干诱发电位（ABR）测试，后取颞骨制作石蜡切片并行HE染色和光镜观察，每组各取两耳行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察。每组各取3只（6耳）行免疫荧光和酶免疫组织化学试验，以检测基因产物表达和腺病毒转染情况。结果：免疫组织化学显示携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞，并产生相应的蛋白产物（IL10和FasL）。ABRⅢ波阈值的均值对比结果显示，A组和B组明显低于C组和D组。内耳组织的免疫炎性反应亦明显较C组减轻。结论：重组复制缺陷型腺病毒可

3、以携带目的基因转导入内耳，并在内耳表达基因产物，其抑制炎症反应的作用可有效地减轻自身免疫性感音神经性聋的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍，有望成为治疗自身免疫性感音神经性聋新的方法和途径。【关键词】基因治疗；自身免疫性感音神经性聋；豚鼠1979年McCabe依据其临床发现，即18例听力障碍患者经过免疫抑制治疗后听力有明显改善，提出了自身免疫性感音神经性聋(autoimmunesensorineuralhearingloss，ASNHL)的概念。之后的进一步研究发现，自身免疫性损害不仅可累及耳蜗，还可波及前庭，故又提出了自身免疫性内耳病（autoim

4、muneinnereardisease，AIED）［12］概念。目前ASNHL的病因和发病机制尚不十分清楚，临床缺乏特异性诊断方法，对于ASNHL患者的治疗亦存在着一些问题，主要是采用皮质激素或免疫抑制剂治疗，虽然疗效较快、较好，但该类药物毒副作用多，而且还存在停药后复发率较高等问题。近年来随着分子生物学研究的深入和基因工程技术的进展，基因治疗已成为许多相关疾病治疗研究方面的热点和新希望。基因治疗是根据特定的治疗目的基因将DNA导入到宿主细胞中并在其中表达。1996年Lalol·L-1pH7.4PBS中，经研磨、冻溶、超声粉碎、匀浆、离心（1000

5、r·min-1，5min）后取上清液，采用紫外分光光度计测定蛋白含量，分装后低温干燥制成CIEAgs干粉备用，保存于-80℃冰箱。1.3ASNHL动物模型制备首次免疫每只动物采用CIEAgs400mg·（0.4ml）-1，加等量完全弗氏佐剂，注射于右后足垫；2周后以CIEAgs200mg·（0.4ml）-1加等量不完全弗氏佐剂，注射于背部多点皮下；间隔2周后，再同样强化免疫1次。依据听觉诱发电位Ⅲ波的阈值升高（超过免疫前全部动物均值加2倍标准差）和出现针对CIEAgs特异性抗体（ELISA法，波长490nm时A值超过免疫前全部动物均值加2倍标准差），

6、判断为ASNHL模型动物制备成功［6］。1.4实验设计ASNHL模型动物共28只，按配对设计分为4组，每组7只：A、B和C组分别向鼓阶内注入携带FasL基因的重组腺病毒(AdFasL)、携带IL10基因的重组腺病毒(AdIL10)和携带绿色荧光蛋白的腺病毒(AdGFP)；D组(即对照组)用同样方法仅向鼓阶内注射磷酸盐缓冲液。1.5重组基因载体鼓阶内注射末次免疫后2周进行。豚鼠用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30mg·kg-1）后，在耳廓后方作一长3～4cm弧形切口，显露听泡，用微型电钻打开听泡，暴露耳蜗底转，用针尖轻轻磨薄耳蜗鼓阶侧壁的骨壁

7、，钻一针尖大小的孔，用微推进器将小儿头皮针的针尖（针尖斜面已打磨变小）插入鼓阶，深度不超过1mm，先抽取少量（约10μl）的外淋巴液，再用微量注射机将重组腺病毒或腺病毒液缓慢（1μl·min-1）注入鼓阶，A组给予AdFASL（病毒滴度为2.5×1010pfu·ml-1）20μl，B组给予AdIL10（病毒滴度为1.0×108pfu·ml-1）20μl，C组给予ADGFP（病毒滴度为1.0×109pfu·ml-1）20μl，D组给予等量的磷酸盐缓冲液,骨蜡封闭耳蜗底转，抗生素冲洗中耳腔3次，部分局部放置氧氟沙星明胶海绵预防感染。骨蜡封闭听泡骨

8、孔，逐层缝合伤口。所有操作应严格遵守无菌原则。1.6特异性免疫反应测试采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定