基因工程与pcr

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1、生物化学CAI课件A第13章基因工程与PCR作者高新旺祁新芝河南省周口卫校目录学习目标PCR技术复习题重点内容：基因工程基因工程学习目标1.说出基因工程的操作步骤2.列出基因工程的主要工具酶3.简述PCR技术的工作原理4.列出PCR的操作步骤学时分配第一节2学时第二节1学时第一节基因工程基因工程又称重组DNA技术，是对携带遗传信息的分子进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域—生物技术工程。一、基因工程的相关概念（一）DNA克隆所谓克隆(clone)就是来自

2、同一始祖的相同拷贝(copy)的的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化，也就是无性繁殖。通过无性繁殖过程获得的“克隆”，可以是分子的，也可以是细胞的，动物的或植物的。在分子遗传学领域所谓的分子克隆专指DNA的克隆。DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质—同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，既DNA克隆。由于早期研究是从较的染色体

3、分离、扩增特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(genecloning)。克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子—嵌合DNA，所以DNA克隆或基因克隆又称重组DNA。实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重组DNA技术，又称基因工程。（二）工具酶在重组DNA技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。1·限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有1800种以上，常用的有几十

4、种。现列举某些限制性核酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌H株分离出的第一种限制酶命名为BamHⅠ）。下表：限制性核酸内切酶5'…GGATCC…3'5'…AGATCT…3'5'…GAATTC…3'5'…AAGCTT…3'5'…GCGG…3'5'…GATC…3'5'…GATATG…3'名称识别序列及切割位点切割后产生5突出末端：BamHⅠBglⅡEcoRⅠHindⅢHpaⅡMboⅠNdeⅠ续表：限制性核酸内切酶名称识别序列及切割位点切割后产生3突出末端：ApaⅠHaeⅡKpnⅠPstⅠSphⅠ切割

5、后产生平末端：AluⅠEcorⅤHaeⅢPvuⅡSmaⅠ5'…GGGCCC…3'5'…PuGCGCPy…3'5'…GGTACC…3'5'…CTGCAG…3'5'…GCATGC…3‘5'…AGCT…3'5'…GATATC…3'5'…GGCC…3'5'…CAGCTG…3'5'…CCCGGG…3'2·DNA连接酶DNA连接酶催化DNA分子中相邻的5‘磷酸基和3’羟基末段之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片连接。3·DNA聚合酶Ⅰ其作用是：①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3′

6、末端4·Klenow片段又名DNA聚合酶Ⅰ大片段，具有完整的DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'聚合、3'→5'外切活性，。常用cDNA于的合成，双链DNA3'末端标记等5·反转录酶其作用是：①合成cDNA②替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补、标记或DNA序列分析6·多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化或标记探针7·末端转移酶在3‘羟基末端进行同质多聚物加尾8·碱性磷酸酶切除末端磷酸基（三）目的基因应用重组DNA技术的目的是为获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物—蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称

7、目的DNA。目的基因有两种类型，即cDNA和基因组DNA。cDNA是指经反转录合成的与RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（然色体及线粒体）的所有DNA序列。目的基因又称外源DNA。（四）基因载体基因载体或称克隆载体，是为携带感兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。可充当基因载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。它们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外

8、源基因的能力。所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,小的2~3kb，大的可达数百kb。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞内独立自主的进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有