基因工程PCR课件

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1、第五章聚合酶链式反应（PCR）基因扩增（geneamplification)1.环境诱发扩增在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。2.基因的程序性扩增在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。3.基因组进化扩增生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。4.基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。5.PCR扩增应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在

2、体外特异性地扩增某个基因。5.1（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。（2）1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实PCR的发明Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。（3）TaqDNA聚合酶1986年H.A.Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替Klenow片段，PCR技术才进入实用阶段。1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应

3、中，使PCR自动循环仪成为可能。（4）PCR仪1988年Cetus公司发明自动热循环仪。5.2PCR扩增原理PCR?是在模板DNA、引物和dNTPS存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。其扩增原理是以半保留复制的形式进行，在体外进行DNA的变性、退火和引物延伸三个阶段的循环反应。PolymeraseChainReaction(PCR)根据已知的DNA核苷酸序列从两个5’-端合成两条16~24bp的引物要进行PCR反应，必须对目的基因片段两侧的序列了解清楚，至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。

4、就可通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段。5.3PCR技术特点pg、ng的DNA模板分子即可。（1）特异性强错配率约万分之一（2×104）。扩增产物的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。（2）敏感性高（4）简便扩增产物直接作序列分析和分子克隆，不必按常规方法先克隆再做序列分析。（3）快速整个PCR过程约4hr完成。样品处理约1hr，PCR2hr，产物凝胶电泳分析约1hr。Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出A碱基末端的双链

5、DNA分子，根据这一发现设计了克隆PCR产物的T-载体。利用Taqpolymerase的特性利用restrictionenzyme（5）可扩增RNAorcDNA有些外显子分散在一段很长的DNA中，难于将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作为模板，可将外显子集中，用PCR一次完成对某些外显子的扩增并进行序列分析。RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。模板可以是cDNA的第一条链，也可以是总DNA。对大批量PCR产物分析不影响，但用于克隆的DNA，必须检测克隆产

6、物的DNA序列。（6）对材料（模板）质量要求低微量、粗制及部分降解的DNA材料都可作为起始材料。（7）有一定程度单核苷酸错误掺入5.4PCR反应体系1.TaqDNA聚合酶①热稳定性TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。②最适温度高最适温度：75~80℃延伸速度：35~150nt/(s·酶分子)最长延伸长度：6.7kb③Taq酶的缺点具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，但没有3’-5’外切酶活性，因此不能修正错误的碱基配对！合成超过600bp长度的DN

7、A就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。其它耐热的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶无3’→5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。②VENTDNA聚合酶有3’→5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100℃高温。③PfuDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！④TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR产物3’端往往带有一个

8、A。①纯度PCR对模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA等试剂。②用量一般50μl反应体系中50ng即可，模板太多，会令扩增失败。2.模板(template)3.引物（primer）终浓度0.5μmol/L4.dNTPs浓度一般反应体系中dNTP混合浓度为200μmol/L，浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。5.Mg2+浓度~2.0mmol/LTaqDNA聚