基因工程-7章pcr技术及其应用

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1、PCR反应的模板重组质粒DNA基因组DNARNA菌落图1口腔腺中提取的RNAM:DL2000marker;1:5μLRNA;2:10μLRNA;3:15μLRNA.M12328S18S5S2021/8/134第七章PCR技术及其应用一、PCR技术原理二、PCR技术的主要类型三、PCR技术应用2021/8/135㈠PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长一、P

2、CR技术原理2021/8/136PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物2021/8/137PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链

3、延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTACC3’DNA聚合酶DNA聚合酶2021/8/138PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链式反应的发明2021/8/139PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana设

4、想被人们遗忘了……2021/8/1310PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链式反应。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行2021/8/1311DNApolermasesforPCR:Thermusaquaticus古细菌-水生栖热菌最适生长温度70℃，具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性2021/

5、8/1312TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040202021/8/1313引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2021/8/131472℃94℃55℃PCR循环2021/8/1315PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻19

6、89年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。㈡PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。2021/8/13162021/8/1317PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)2021/8/1318TargetSeque

7、nceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93-95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences2021/8/1319TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板D

8、NA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72℃TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomple