不同产地杜仲皮内生真菌种群结构比较研究

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1、不同产地杜仲皮内生真菌种群结构比较研究［摘要］为探讨不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的差异，采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义3个产地杜仲皮内生真菌，通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定，共分离得到152株内生真菌，分属于8个属，其中Phomopsis,Diaporthe,Alternaria为3个产地内生真菌共有属，各产地的优势种群不同。相似性分析表明，不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异；多样性及均匀度分析表明，慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高，分布较均匀。遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数最低

2、，优势种群集中，奇异度较高。拟茎点菌属与其有性态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析，不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富。综合分析认为，杜仲皮组织的内生真菌具有多样性，慈利、遵义和略阳3个产地内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异。［关键词］杜仲皮；产地；内生真菌；rrs;多样性［收稿日期］2013-07-31［基金项目］国家科技支撑计划项目(2011BAI01B08)；湖南省自然科学基金项目(14JJ4069);湖南中医药大学研究生创新课题项目(2012CX04)［通信作者］*张水寒，教授，博士生导师，研究方向为中药资源、中药制

3、剂及质量标准，Tel:(0731)88881651,E-mai1:zhangshuihan0220@126.com杜仲EucommiaulmoidesOli是杜仲科单属植物，为我国特有的经济树种，同时又是名贵的滋补药材。传统杜仲以树皮入药，药材的中心产区在湘西北、黔北、黔西及陕南等地［1］。不同产地杜仲药材的品质有差异，据文献初步研究报道，外部环境因子如产地气候［2］、土壤［3］等可能是造成产地差异性的因素。近年来，关于杜仲内生真菌的研究逐渐引起了人们的重视，相关研究表明，杜仲内生真菌对多种病原真菌都有抑菌活性［4］，且从多种杜仲内生真菌发酵提取物

4、中检测到与宿主相同的药效物质成分，如松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸［5-7］等，这些成分是评价杜仲药材质量的重要指标［8］。可见，杜仲内生真菌作为构成植物内环境的重要组分，对杜仲植物生长、其次生代谢产物积累及药材品质等均具有较大的影响。由于同一种植物生长在不同的环境，其内生菌的多样性及生物活性都有所不同［9-10］，本实验拟从杜仲内生真菌的角度，研究不同主产区的树皮内生真菌的种群结构的差异，分析差异产生的原因，以期为寻找内生真菌与外部环境的相关性提供一定的线索，也为内生真菌与不同产地杜仲药材品质差异的相关性研究奠定基础。1材料1.1样品采集2012年11

5、月，分别在杜仲主产区：贵州遵义枫香镇、湖南慈利江垭林场、陕西略阳县天台村随机选取5棵7〜8年生健康的杜仲树，在离地1〜1.5m高处，剥取新鲜干皮后置于无菌保鲜袋中，并于4°C保存备用。1.2培养基［11］内生菌分离、纯化及菌种保藏均采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，液体发酵培养基采用马铃薯葡萄糖（PD）培养基。1.3主要仪器与试剂SW-CJ-2D型净化工作台（苏州净化）、THA-3560C高压蒸汽灭菌锅（造鑫企业有限公司）、ZSD-1270型生化培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）;QHZ-98B全温光照振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）；M

6、oticBA-400数码成像光学显微镜（武汉麦克奥迪仪器仪表有限公司）。琼脂粉（福建泉州市泉港化工厂，批号2009002）、葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，批号F20111208）、次氯酸钠溶液（广东光华科技股份有限公司，批号20120203）；CTAB,0-巯基乙醇，Tris,冰醋酸，氯化钠（均为国产试剂）；自制超纯水。2方法2.1内生真菌的分离、纯化及保藏［11-12］取3个产地的杜仲皮适量，先用水冲洗外表至干净，滤纸吸干表面的水分。用无菌刀将样品切割成约3cmX3cm的小块，在75%乙醇溶液中浸泡2min，用无菌水冲洗样品表面3次，无菌滤纸

7、吸干；再用5.5%次氯酸钠溶液浸泡3min后，用无菌水冲洗样表面5次，无菌滤纸吸干。用镊子及解剖刀刮去栓皮层，取其中心韧皮部约0.4cm2的小块，贴于PDA培养基的表面，每皿放2块材料，于28°C恒温培养箱内培养3〜10d。待菌丝从植物组织长出后，及时从边缘挑取菌丝移至新的PDA平板上，采用菌丝顶端纯化法对分离出的菌种逐步进行纯化。纯化后的菌种接种于PDA斜面试管上，并放4°C保存。把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于PDA平板上，作为漂洗检验对照；将上述表面灭菌处理的组织块贴于PDA平板上，使其与培养基接触20min后，移去植物材料，作为组织印记对照

8、，于相同条件下培养、观察，以确保表面灭菌彻底，分离出的为内生菌。2.2形态鉴定按照真菌经典分类方法，平板培养之后观察菌落特