pcr技术将在临床检验领域迎来新契机

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1、PCR技术将在临床检验领域迎来新契机来源：广东咲学2010年2月第31卷第3期周高英，叶锋北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司(北京100176)1985年，Mullis发明的聚合酶链式反应(PCR)技术在医学界掀起了基因诊断技术的热潮，PCR技术凭借快速、简便、灵敏等优点以惊人的速度广泛应用丁•临床基因诊断等领域，成为现代医学发展的又一里程碑。但十多年的临床实践表明，PCR技术木身在工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR产品标准化等力*诎还存在着若干弊端，这导致检测结果上的差异，这已经成为当前困扰临床医师、实验室技术人员以及患者的荇遍问题。本文将从PCR技术产业发展回顾、诊断试剂

2、的标准化以及PCR技术在临床检验领域的新契机等3个方面进行阐述。1PCR技术及产业发展历史回顾1985年，美国MULLIS等［1］发明丫具冇划时代意义的漱合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)技术，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实，并依靠此项技术获得1993年诺贝尔化学奖。1989年，Hoffmann—LaRoche公司和Cetus公司开始将PCR技术应用于临床诊断领域。1996年，美国AppliedBiosystems公司推出全球首款实时荧光定莆PCR技术，并在欧美各国悄然兴起，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定景的飞跃，而且与

3、常规PCR相比，它具冇特异性更强、冇效解决PCR污染、自动化程度髙等特点，因而在各级临床实验室得以迅速推广13］。PCR技术于90年代中期在国内全诎展开临床应用工作，但是由于传统的PCR技术本身存在着许多局限性(如产物不能准确定量、界易交义污染、导致假阳性等)，在1998年遭到了卫生部门的明令禁止。此后，由于荧光定SPCR技术的出现以及国内外学者的不懈努力，政府相关部门于2002年颁布《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》等一系列池入文件，从制度上规范了PCR实验室运作，建立起冇效的质呈保防体系［4］。目前，己有多家国内外生产厂商涉足研发生产适

4、川子临床诊断的PCR检测试剂盒，并在PCR产品市场中占得先机。经过多年的发展和完莕，荧光定量PCR技术在国内科研、检测和诊断领域己得到广泛应用，无论是产品种类、产品质ffi、技术优势和市场规模均可与国外厂家相媲美，另外，由于试剂价格远低于进口产品，国产PCR诊断试剂占领了绝大部分国内市场份额。2临床PCR诊断试剂产品的弊端临床实验室检验标准化并非单一因索，它由诸多关键性环节组成，其中工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR试剂产品标准化是PCR临床检验标准化的核心内界。目前国家颁布的《临床基闻扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床驻因扩增检验实验室工作规范》等一系列准入文件从根本上

5、规范了工作流程标准化问题；对PCR仪器标准化而言，一些进UPCR仪器依靠商度的稳定性、可爾复性和商效的数据分析软件，己实现了实验数据的u了靠性和标池化操作流程；由于价格#优，国产PCR诊断试剂片据了国闪的大部分市场，但足由丁•不同的厂家缺乏统一的检奔标准，往往使得同一实验室不同检测批次问或不同实验室对M—标本检测间结果存在较大差异。这己经成为困扰临床医生、患者以及实验室技术人员的齊遍问题，这也是当前不同实验室闾结果有条件互认的一个巨大障碍。H前对于PCR诊断产品标准化主要存在以下4个问题：2.1定景的目的和意义不明除少数种类试剂外，目前己上帘的大部分试剂盒并不是报告原始样木中病原

6、体的浓度，而足核酸提取产物的靶基因浓度，并不能真正反映原取材样木的靶基因的真IE含量。选择合适的实验标本是减少实验误差的第一个过程，然而不M实验的实验样品并不具有通用性，很难确保实验样品的均-性。在人体，血液样本容易收集、相对恒定、能确保不同样本间的比较，对血液中病原体进行定莆检测更精确且有实际意义。然而对于如鉍液、痰液、淋巴液、拭子、组织块等样本，由于采样时忠者的生理状况和取样部位等因素，虽然用物理、化学或酶的方法对标本进行Y处理，但仍然无法做到均一性和可比性，因此其所训的定眾仪仪足针对核酸提取物中靶褪因定觉。2.2定量的依据不妥据调齊，目前市场上PCR定量试剂无一例外都采用质

7、粒做为试剂盒定量标准。由于质粒是一种人为构建的脱氣核糖核酸载体，环状物理构象存在特殊性，和线性的基因组DNA相比，PCR扩增效率上其有差别。因此，先进行质粒拷贝数定值，再通过比较各个样品扩增曲线Ctffi來获得病原体基因组DNA的浓度，这样的流程缺乏严谨的逻辑依据。宥些厂家甚至用质粒标定RNA（宥的病毐遗传物质为RNA）撈W数，就史加无裾讨依。同时，采用勾待检样本性质差异很大的质粒作为标准品或质控品，也无法回避检测过程的基质效应。2.3定量的准确性不能保证核酸提取：临床样本的多样